Role Proteinu Modifikace T-Bet v Produkci Cytokinů a Diferenciaci pomocných T Buněk

Abstrakt

T-Bet (T-box proteinu vyjádřené v T buněk, nazývané také jako TBX21) byl původně klonovaný jako klíčový transkripční faktor podílející se na závazek T helper (Th) buňky Th1 linie. T-Bet přímo aktivuje transkripci genu IFN a zvyšuje vývoj Th1 buněk. T-Bet současně moduluje IL-2 a Th2 cytokiny IFN-nezávislým způsobem, což vede k útlumu vývoje TH2 buněk. Četné studie prokázaly, že T-bet hraje více rolí v mnoha podtypech imunitních buněk, včetně B buněk, dendritických buněk, buněk přirozeného zabijáka (NK), NK T buněk a vrozených lymfoidních buněk. Proto je T-bet zásadní pro rozvoj a koordinaci vrozených i adaptivních imunitních odpovědí. Ke splnění těchto více rolí, T-vsadím se, že podstoupí několik posttranslační modifikace bílkovin, jako je fosforylace na tyrosin, serin a threonin reziduí, a ubikvitinace na lysinových zbytků, které ovlivňují lineage závazek během Th buněk diferenciace. Tento přehled představuje aktuální přehled pokroku dosaženého v porozumění úlohám různých typů modifikací proteinů t-bet v regulaci produkce cytokinů během diferenciace TH buněk.

1. Úvod

T-Bet (T-box proteinu vyjádřené v T buněk, také volal TBX21) byl nejprve popsán v roce 2000 ve zprávě zkoumá účinky T-sázka na diferenciaci T helper 1 (Th1) buněk . Za posledních 15 let mnoho studií zkoumalo funkce T-bet a odhalily více rolí pro tento protein během Th buňky, diferenciace, se zaměřením na molekulární mechanismy zapojené, román funkcí tento transkripční faktor v vrozený imunitní buňky, a T-bet-zprostředkovaná modulace zánětlivých onemocnění . Bylo objasněno, že T-vsadím se, že hraje klíčovou roli v koordinaci přirozené imunity a adaptivní imunity, a že plní důležitou funkci v modulaci chronických zánětlivých onemocnění, včetně astmatu a zánětlivých onemocnění střev, tím, že řídí síť vysoce zachovány genetické programy . Zdá se tedy, že optimální regulace exprese a aktivity T-bet je prospěšná pro prevenci nebo léčbu chronických zánětů a autoimunitních onemocnění.

i když pokusy byly provedeny na identifikaci malých molekul, které kontrolují expresi a aktivitu T-bet, které ovlivňují T buňky-mediated imunitní odpověď, bylo dosaženo jen malého pokroku na toto datum. Vzhledem k významu T-bet v imunitní regulaci, objasnění funkční mechanizmy více rolí T-vsadím se, že by to usnadnilo rozvoj nových terapeutických intervencí pro léčbu chronických zánětlivých a autoimunitních onemocnění. Tento přehled shrnuje současný stav znalostí o molekulárních mechanismech, které jsou základem více rolí, které hraje T-bet ve vývoji TH buněk.

2. Struktura T-Bet,

T-vsadím se, že obsahuje amino-konci, T-box doménu, a karboxylovou-konci, které ukazují, 82%, 100% a 79% homologie, respektive mezi myší (530 aminokyselin zbytky bílkovin) a člověka (535 aminokyselin zbytky protein) (Obrázek 1). Doména T-box, která se nachází mezi zbytky 135 a 326 v myším t-bet, je vysoce konzervována u 18 členů rodiny T-box proteinu (TBX). Společné rysy sdílené proteiny T-box zahrnují schopnost vazby DNA prostřednictvím domény T-box a transkripční regulační aktivitu, která hraje roli při kontrole exprese vývojového genu u všech živočišných druhů.

Obrázek 1

Struktura a modifikace proteinů T-bet. Myš a člověk T-bet je 100% identické v doméně T-box. Několik aminokyselinové zbytky jsou zachovány v myších a podstupují posttranslační modifikace, včetně fosforylace na serinu, threoninu, a/nebo tyrosin reziduí, a ubikvitinace na lysinových zbytků.

T-box doména se skládá z asi 180 aminokyselin zbytky a je dostatečná a nezbytná k vazbě na konsensus sekvence DNA TCACACCT . Brachyury (T) byl první T-box protein musí být identifikovány a, v dimerní formě, komunikuje s hlavní a drobné drážky DNA přes hydrofobní interakce a neobvyklé hlavní řetězce karbonylové kontaktu s guanin jako dimer . TBX1 se také váže na sekvenci DNA jako dimer, zatímco TBX2 se zdá, že se váže na stejnou sekvenci DNA jako monomer . I když TBX1 a TBX2 podíl 61% identitu v T-box domény, struktura DNA-T-box závazné komplex se zdá být jiný, protože nízké homologie mezi amino – a karboxylové terminální regiony. T-box domény v T-bet ukazuje 50% homologie s odpovídající domény v brachyury (T), TBX1, a TBX2; nicméně, krystalové struktury T-bet vázány na sekvenci DNA zůstává být charakterizovány.

3. Regulace diferenciace TH buněk pomocí t-Bet

3.1. Stimulace diferenciace Th1 buněk pomocí T-Bet

T-bet se přímo váže na konsensuální sekvenci DNA v promotoru IFNG a aktivuje její transkripci. Exprese IFNG indukovaná T-bet odvozuje TH prekurzorové buňky, aby se diferencovaly na efektorové buňky Th1. Zatímco exogenní nadměrná exprese T-bet v dosud neléčených TH buňkách přednostně zvyšuje vývoj TH1 buněk, nedostatek t-bet vede k selhání produkce dostatečného IFN-γ, a proto snižuje tvorbu TH1 buněk . Exprese T-Bet je podstatně zvýšena stimulací receptoru T buněk (TCR) a je rozšířena cotreatmentem s IFN-γ a IL-12. IFN-γ se váže na svůj receptor a indukuje aktivaci signálového převodníku a aktivátoru transkripce (STAT) 1 a transkripci t-bet genu (TBX21). Následně T-bet přímo stimuluje transkripci IFNG i IL12RB2. Exprese β2 receptoru IL-12 (IL-12R) na buněčném povrchu dále zvyšuje produkci IFN-γ prostřednictvím IL-12 a signální dráhy STAT4, což vede k preferenční diferenciaci TH1 buněk. Zajímavé je, že vynucená exprese T-bet může také převést diferencované TH2 buňky na TH1 buňky . Proto je T-bet umístěn v jádru regulačních drah, které indukují IFN-γ v TH buňkách.

3.2. Útlum produkce IL-2 Pomocí T-Bet

kromě regulace IFN-γ T-bet významně potlačuje expresi. Tento cytokin, časný růstový faktor T buněk, je nezbytný pro aktivaci, proliferaci a diferenciaci TH buněk a je hojně produkován při stimulaci TCR. Ektopicky zavedený T-bet významně potlačuje produkci IL-2 inhibicí aktivity jaderného faktoru kB (NF-kB) p65 za podmínek diferenciace Th1 i Th2 . Během diferenciace TH1 buněk je transkripce IL-2 také oslabena po indukci T-bet. Inhibice IL-2 zprostředkovaná t-bet může ovlivnit expanzi TH buněk a skvěle modulovat imunitní odpověď zprostředkovanou Th1 po expozici patogennímu antigenu.

3.3. Potlačení Th2 Buňky Vývoj T-Bet,

Kromě toho, exogenní T-bet úvod do Th buňky, potlačuje produkci Th2 cytokinů, jako jsou IL-4, IL-5 a IL-13, via potlačení GATA-vázající protein-3 (GATA-3). Proto nedostatek T-bet indukuje spontánní vývoj Th2 buněk in vitro a in vivo . Th2-supresivní aktivita T-bet byla také potvrzena v nepřítomnosti IFN-γ, což naznačuje, že T-bet má diskrétní inhibiční funkci nezávislou na stimulaci IFN-γ.

3.4. Ostatní Funkce T-Bet,

v Poslední době, mnoho studií uvádí, že T-vsadím se, že také moduluje jiné Th buněčných linií, včetně Th17, Treg, a folikulární Th (TFH) buňky, v koordinaci s mnoha transkripčními faktory, jako je kyselina retinová-related orphan receptor-yt (RORyt), runt-related transcription factor 3 (RUNX3), a B-cell lymfom-6 (BCL6) . Tato zjištění naznačují, že T-bet je transkripční faktor, který je rozhodující pro jemné doladění vývoje TH buněk.

4. Posttranslační modifikace T-Bet

t-Bet funguje jako multitaskingový hráč v regulaci diferenciace TH buněk. Molekulární mechanismy, které jsou základem stimulační a inhibiční aktivity T-bet při regulaci exprese cílového genu, je však třeba objasnit. Mnoho multitasking proteiny jsou známo, že podstupují posttranslační modifikace bílkovin a určit mobilní osudy vyvíjet přímý stimulační a nepřímý inhibiční aktivity na cílové genové exprese .

4.1. Tyrosin Fosforylace T-Bet,

na základě Protilátek, detekce T-bet proteiny na western blot výsledky v několika kapelách, což naznačuje, že posttranslační modifikace T-bet v TCR aktivaci Th buněk. Tyrosinová fosforylace t-bet proteinu se vyskytuje primárně v časných stádiích (dny 2 až 3) vývoje TH buněk, po zapojení TCR a poté klesá. Léčba TH buněk inhibitorem tyrosinfosfatázy pervanadátem zvyšuje tyrosinovou fosforylaci T-bet. T-Bet je hlavně lokalizován v jádře, a jaderné tyrosin kinázy IL2-indukovatelných tyrosin kinázy (ITK) byl identifikován jako zodpovědný proti proudu tyrosin kinázy. Nedostatek ITK zabraňuje tyrosinové fosforylaci T-bet v TH buňkách po stimulaci TCR a IL-12. Mutační výzkumu bylo zjištěno, že tyrosin reziduí 525 (Y525) je relevantní fosforylace stránky a že fosforylace na tomto místě hraje důležitou roli v interakci s GATA-3. I když T-box domény v T-bet je důležité pro DNA a protein-protein interakce, tyrosin fosforylace Y525 je předpokladem pro potlačení GATA-3-zprostředkované Th2 diferenciaci buněk. Blokáda fosforylace Y525 ruší interakci a potlačení GATA-3, což vede k narušení suprese Th2 .

Navíc, další jaderné tyrosin kinázy c-Abl, indukuje fosforylaci T-bet na tyrosin reziduí, 219, 265, 304 v myši T-bet . Nedostatek v c-Abl, stejně jako mutace T-bet na těchto zbytků (Y219/265/304F mutanti) vede k selhání na zvýšení IFN-γ indukce a k potlačení Th2 cytokinové produkce, vzhledem ke ztrátě fosforylace na tyto tyrosin reziduí. To zase vede ke zhoršení alergického zánětu plic in vivo . Tato zjištění naznačují, že fosforylace t-bet vyvolaná ITK a c-Abl je nezbytná pro modulaci vývoje Th2 buněk a alergickou imunitní odpověď.

4.2. Serinová Fosforylace T-Bet,

i když T-bet-zprostředkované potlačení Th2 buňky vývoje je narušena mutace Y525 a absence c-Abl kinázy, IL-2 supresi je zachován s Y525-mutant T-bet, což naznačuje existenci dalších regulačních mechanismu pro IL-2 modulace . Zajímavé je, že vzhled více pásem T-bet proteiny na western blot mohly být odstraněny přidáním tele střevní fosfatázy, které převážně eliminuje fosforylace na serinu/threoninu zbytků. Hmotnostní spektrometrická analýza pak odhalila serin 508 (S508) jako další fosforylační místo v T-bet. Mutace S508 ruší kasein kinázy- (CK-) a glykogen syntázy kinázy-3 (GSK-3-) zprostředkované fosforylace v T-bet, stejně jako IL-2–supresivní aktivitu proteinu. Fosforylace S508 je navíc důležitá pro interakci T-bet S NF-kB p65 a pro prevenci vazby NF-kB p65 na promotor IL2. V souladu s funkcí t-bet jako inhibitoru NF-kB p65 buňky t-bet-null Th1 udržují aktivitu NF-kB p65 během diferenciace buněk Th1 a produkují tak více IL-2. Proto bylo navrženo, že T-bet je fyziologickým inhibitorem IL-2 během diferenciace Th1 buněk prostřednictvím suprese NF-kB p65 závislé na fosforylaci s508.

4.3. Threonin Fosforylace T-Bet,

Velmi nedávno, threonin 302 (T302) byl charakterizován jako nové fosforylace stránky v T-bet , i když zůstává nejasné, které kinázy a fosfatázy ovlivňují fosforylaci tohoto zbytku. Nicméně, obnova T-bet-null Th buňky s T302-mutant T-bet stimulovány IFN-γ stejně jako wild-type T-bet; nicméně, mutant se nepodařilo potlačit IL-2 a další Th2 cytokiny. Další analýza prokázala, že T302 fosforylace je nutná pro interakci T-bet s nukleární faktor aktivovaných T-buněk (NFAT) a pro down-regulaci NFAT-mediated IL-2 a Th2 cytokinů, jako jsou IL-4, IL-5 a IL-13. NFAT je zásadní pro indukci IFN-γ a T302-mutant T-bet je schopen se vázat na IFNG promotér; tak, IFN-γ byla srovnatelná mezi typem wild-type a mutantních T-bet. Jinými slovy, mutace T302 zrušila potlačení produkce IL-2 a Th2 cytokinů zprostředkované T-bet, ale neovlivnila aktivitu T-bet vázající se na DNA a IFN-γ-stimulační aktivitu.

T302 je ve skutečnosti umístěn v T-boxu vázajícím DNA, stejně jako Y304 . Doména T-boxu se skládá z několika opakování β-řetězců a α-šroubovic a podílí se jak na dimerizaci, tak na vazbě DNA . Muller a Herrmann předpověděl, že α-šroubovice aH3 a aH4 v brachyury (T) jsou důležité pro přímou interakci tohoto proteinu s vedlejší a hlavní drážky DNA . T302 však nemusí být spojen přímo s drážkami DNA, bez ohledu na jeho fosforylační stav. Bylo by zajímavé vědět, která upstream kináza a fosfatáza reguluje fosforylaci T302 a zda fosforylace T302 ovlivňuje další proteinové modifikace T-bet.

4.4. Ubikvitinace Lysinu 313 v T-Bet,

T-vsadím se, že výraz je rozhodující pro transkripční regulace IFNG a pro rozvoj Th1 buňky, ale způsob regulace T-bet na proteinové úrovni je ještě třeba identifikovat. Jang et al. nedávno uvedli, že T-bet prochází ubikvitinací zprostředkovanou proteazomální degradací během pozdějších stadií diferenciace TH1 buněk . 16 lysin reziduí přítomných v myši T-bet bílkovin, 11 jsou převážně umístěny v T-box doménu, a zbývajících 5 se nachází v karboxyl-koncové (zbytky 326 přes 530), zatímco žádné lysin rezidua jsou přítomna v amino-konci (zbytky 1 až 134). Je zajímavé, že lysinové zbytky v doméně T-box jsou přednostně ubikvitinovány při nadměrné expresi ubikvitinu. Další analýza zjistila, že mutace lysinu 313 (K313) snižuje ubikvitinace-zprostředkované T-bet degradaci a zvyšuje hladina exprese T-bet v jádře a cytoplazmě. Navzdory zvýšeným hladinám mutantu k313 tato mutace zcela zrušila funkce T-bet zahrnující vazbu DNA, transkripční aktivaci IFNG a potlačení produkce cytokinů IL-2 a Th2. Krystalová struktura α-šroubovice domény T-boxu vázané na DNA silně naznačuje, že aminoskupina K313 je spojena s fosfátem DNA báze interakcí vodík-vazba. Kromě toho, mutace K313 také vede k selhání potlačit IL-2 a Th2 cytokinové produkce; nicméně, interakce s a potlačení GATA-3 a NF-kB p65 nejsou ovlivněny mutace K313. Zajímavé je, že interakce NFAT je zrušena v k313-mutantním t-bet, což je také silně spojeno s nepřítomností fosforylace u T302. Zatím není jasné, zda a jak k313 reguluje fosforylaci T302 a naopak.

5. T-Bet u zánětlivých a autoimunitních onemocnění

protože Mosmann et al. objevil Th1 a Th2 subtypů, které produkují podpis cytokiny IFN-γ a IL-4, IL-5 a IL-13, respektive, a které modulují zánětlivé a alergické imunitní odpovědi , další studie identifikovali román podskupin Th buněk, jako Th17, TFH, a Treg buněk . Rozsáhlé studie také charakterizovaly cytokinové signální dráhy a transkripční faktory podílející se na regulaci imunitní odpovědi na patogeny . Důležité je, že T-bet hraje zásadní roli při kontrole diferenciace několika podmnožin Th buněk a při modulaci zánětlivých a autoimunitních onemocnění .

T-Bet také funguje jako antiastmatický regulátor. Nedostatek v T-bet spontánně vede k rozvoji příznaků astmatu, který se vyznačuje zvýšenou eosinofilní infiltrace do dýchacích cest, hlenu secernujících pohárkových buněk hyperplazie, chronické dýchací cesty přestavby s akumulaci kolagenu a proliferujících myofibroblastů; tyto funkce jsou také často vidět u astmatických pacientů . Obnovení exprese T-bet posouvá imunitní rovnováhu na odpověď Th1 a zabraňuje a zmírňuje patologický zánět plic in vivo .

kromě toho je T-bet chráněn před intracelulárními patogenními infekcemi. Zrušení T-bet-indukované IFN-γ za následek vyšší náchylnost k intracelulárním patogenům in vivo, včetně Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major, a Salmonella typhimurium , s důrazem na význam IFN-γ T-bet-vyjádření Th1 buňky v obraně proti bakteriálním infekcím. Nicméně, T-bet-deficitní myši jsou rezistentní k infekci Listeria monocytogenes, protože INF-γ nk buněk je nezbytné a dostatečné pro hostitele obrany proti L. monocytogenes .

Kromě toho, T-bet může zhoršit vývoj zánětlivých a autoimunitních onemocnění, včetně zánětlivého onemocnění střev, experimentální autoimunitní encefalomyelitida, zánětlivá artritida, a diabetes typu I, jako tyto zánětlivých onemocnění jsou oslabené v nepřítomnosti T-bet . Tato zjištění naznačují, že jemné doladění imunitní odpovědi modulací exprese T-bet by mohlo mít příznivé účinky u pacientů s chronickým astmatem, zánětlivým onemocněním střev, artritidou, roztroušenou sklerózou a diabetem.

6. Závěry a Perspektivy

T-bet je T-box domény obsahující transkripční faktor, který je obvykle zapojen ve vývojové nařízení, ale vykonává více funkcí v Th buněk diferenciace; transkripční aktivace IFN-γ-vyjádření Th1 buněk, nepřímé potlačení Th2, Th17 a Treg buňky vývoje a jemné modulace IL-2 produkce Th1 buněk. Tento multitasking není překvapující, protože T-bet prochází několika posttranslačními úpravami. Fosforylace na Y525 hraje roli v GATA-3 během potlačení Th2 nařízení, fosforylace na S508 způsobuje NF-kB p65 potlačení v souvislosti s IL-2 nařízení v Th1 buněk, fosforylace na T302 hraje roli jemného doladění IL-2 produkce, a ubikvitinace na K313 hraje roli v kontrole T-vsadím se, že proteinové stability. Posttranslační modifikace T-bet tedy usnadňuje jeho funkční rozmanitost a složitost jeho modulace exprese cytokinů (Obrázek 2). Není známo, zda různé posttranslační modifikace dojít postupně nebo současně, zda jeden typ modifikace proteinů ovlivňuje další změny, nebo zda změny v posttranslační modifikace T-vsadím se, že jsou v souvislosti s rozvojem infekčních a chronických zánětlivých onemocnění. Další identifikace nových proteinových modifikací souvisejících s funkcemi T-bet by poskytla cenné poznatky o vývoji silných terapeutických intervencí pro kontrolu chronických zánětlivých a autoimunitních onemocnění.

Obrázek 2

více funkcí T-bet hraje roli v diferenciaci TH buněk. Indukce T-vsadím se, že vyjádření prostřednictvím aktivace STAT1 a STAT4 přímo stimuluje transkripci T-box-binding element obsahující geny, jako IFNG, IL12RB2, a CXCR3, čímž se zvyšuje Th1 buňky vývoje. T-Bet podléhá serinové fosforylaci při S508 a poté snižuje produkci IL-2 v TH1 buňkách rekrutováním NF-kB p65 z promotoru IL2. Hladiny proteinu t-bet v buňkách Th1 mohou být řízeny cestou proteazomální degradace zprostředkovanou ubiquitinem. Kromě toho, T-vsadím se, že protein prochází další posttranslační modifikace, například fosforylace na T302 a Y525, což usnadňuje jeho potlačení Th2 cytokinové produkce, která je vyvolaná aktivace NFAT a GATA-3.

Seznam Zkratek

střet zájmů

nebyl zveřejněn žádný potenciální střet zájmů.

Potvrzení

Tato práce byla podpořena Mid-Kariéry Výzkumníka Programu prostřednictvím NRF Grant (2013R1A2A2A01068302).