efeito regulador da melatonina nas Perturbações da citocina nos ratinhos lúpus induzidos pelo Pristano

Abstract

lúpus eritematoso sistémico (les) desenvolve-se em relação a muitos factores ambientais. Em nossa opinião, é mais importante investigar o efeito da melatonina no Les relacionado com o meio ambiente. No presente estudo, foram utilizados 0, 5 ml de pristano para induzir Les em ratinhos fêmea BALB/C. A melatonina (0, 01, 0, 1, 1 mg/kg) foi administrada por via oral imediatamente após a injecção de pristano durante 24 semanas. Foram detectados anticorpos IgM anti ssDNA e histona após uma injecção de pristano de 0, 1, 2, 4, 8 semanas. Os níveis de IL-2, IL-6 e IL-13 foram detectados após 24 semanas. Foram também observadas lesões renais. Os resultados mostraram que a melatonina antagonizava os níveis crescentes de IgM anti ssDNA e de histona auto-anticorpos. A melatonina também pode diminuir a produção IL-6 e IL-13 e aumentar a produção IL-2. Além disso, a melatonina pode diminuir as lesões renais causadas pelo pristano. Estes resultados sugerem que a melatonina tem um efeito benéfico sobre o lúpus induzido pelo pristano através da regulação dos distúrbios das citocinas.

1. Introdução

lúpus eritematoso sistémico (Les ou lúpus) é uma doença auto-imune que pode atacar o tecido e as células normais do organismo, resultando em inflamação e danos nos tecidos . A les ocorre em qualquer idade e em qualquer sexo. No entanto, as mulheres são mais propensas a ter Les do que os homens . Além disso, distúrbios na rede de citocinas também foram relatados em Les , incluindo IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 e IFN-. Estas citocinas têm relações estreitas com o desenvolvimento de Les, tais como a produção de auto-anticorpos e nefrite imunocomplexa. Mas há alguns resultados contraditórios sobre as mudanças de algumas citocinas em diferentes relatórios.Nos últimos anos, tem sido dada cada vez mais atenção aos factores ambientais que podem estar implicados na patogénese da les . As doenças auto-imunes estão se tornando cada vez mais comuns nos países industrializados, e essas doenças podem ser influenciadas por fatores ambientais . Pristane é um provável candidato como um gatilho ambiental de Les em população suscetível. Experiências em animais mostraram que o pristano pode induzir sintomas de doença autoimune tipo lúpus numa estirpe de ratinhos (BALB/c), tais como níveis elevados de auto-anticorpos e glomerulonefrite imunocomplexa . Algumas investigações epidemiológicas também provaram que todas as pessoas com pristano em seu sangue tinham doenças auto-imunes distintas ou sintomas de doença auto-imune . Além disso, o pristano encontrado em óleo mineral, óleo de tubarão, e muitos alimentos parecem ser uma possível exposição ambiental que pode desencadear les. Por isso, pode ser mais apropriado pesquisar factores ambientais envolvidos na SLE utilizando o modelo murine de tipo Murine, induzido pelo pristano.

a melatonina é sintetizada e secretada principalmente pela glândula pineal que pode produzir receptores específicos dentro e fora do sistema nervoso central. A melatonina não só pode afetar diretamente a inflamação e as células imunitárias, mas também tem influências indiretas sobre ela através da talamencefalia . Mais importante ainda, a melatonina é considerada como uma substância activa importante no sistema neuro-imune-endócrino . É capaz de regular o desequilíbrio da rede citoquina em algumas doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide e artrite adjuvante . Algumas experiências investigaram os seus efeitos em ratinhos LMR-lpr/lpr e mostraram que a melatonina era benéfica para o Les espontâneo em ratinhos fêmea . Uma vez que o ambiente é um fator importante na SLE na sociedade moderna, estávamos mais interessados nos efeitos da melatonina no SLE relacionado ao meio ambiente.

para investigar o papel da melatonina na les, especialmente no lúpus relacionado com o ambiente, foram utilizados ratinhos induzidos pelo pristano. Foram também determinados os efeitos da melatonina nos distúrbios da citoquina e as seguintes alterações no modelo de Les induzido pelo pristano.

2. Materiais e métodos

2.1. Animais

sessenta fêmeas BALB/c ratinhos com dois meses de idade (g) foram fornecidos pelo Centro Experimental Animal da Universidade Médica de Anhui. Todos os protocolos experimentais descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê de exame ético para experimentação Animal do Instituto de Farmacologia Clínica, Universidade Médica Anhui.

2.2. Materiais

melatonina foi comprada a Sigma. O pristano, o timo do vitelo desnaturado pelo calor (ssDNA), o timo histona do vitelo total (histona), a concanavalina A (ConA) e os lipopolissacáridos (LPS) também eram da Sigma. Foram adquiridos anticorpos IgM anti-rato-coelho conjugados com biotina e avidina marcada com peroxidase de rábano silvestre . Os kits ELISA interleucina-2 e os kits ELISA interleucina-6 foram comprados à ADL. Os kits ELISA de interleucina-13 foram comprados da BIOO.

2.3. Protocolos experimentais

Sessenta fêmea BALB/c os ratos foram divididos aleatoriamente em seis grupos: grupo de controlo normal, grupo modelo, prednisona-grupo de tratamento, que serviu como controle positivo do grupo, e melatonina (0.01, 0.1, 1.0 mg/kg) grupos de tratamento, incluindo a melatonina grupo um (MT1), melatonina grupo dois (MT2) e a melatonina grupo de três (MT3). Aos ratinhos do grupo de controlo normal foi administrada uma injecção intraperitoneal de 0.5 ml de solução salina normal (NS) e aos outros grupos foi administrada uma injecção intraperitoneal de 0, 5 ml de pristano. Os ratinhos do grupo de controlo normal e do grupo de controlo do modelo receberam administração intragástrica de NS por dia após o primeiro tratamento. Aos ratinhos do grupo controlo positivo foi administrada uma administração intragástrica de 5 mg/kg de prednisona (pré) por dia. Os ratos em MT1 grupo foram intragastrically tratados com 0,01 mg/kg de melatonina, MT2 0,1 mg/kg de melatonina, e MT3 1,0 mg/kg de melatonina. Os soros foram recolhidos na veia da cauda antes do tratamento (0) e 2, 4 e 8 semanas após o tratamento para medir o nível de auto-anticorpos. Vinte e quatro semanas após a administração de pristano, todos os ratos foram mortos, e os bílis foram removidos para detecção imunológica; enquanto isso, os tecidos nefric foram examinados por microscopia de luz.

2.4. Os testes Imunoabsorventes enzimáticos (ELISAs) para anticorpos Anti-ssDNA e histona

anticorpos Anti-ssDNA e IgM histona foram detectados por uma técnica ELISA semelhante à descrita em . As placas ELISA de 96 alvéolos revestidas com 10 mg/L de ssDNA ou antigénios da histona foram incubadas durante a noite às 4. No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBS-Tween. As placas foram incubadas com tampão de bloqueio (PBS-2% de albumina sérica bovina) durante a noite às 4 horas e lavadas com PBS-Tween. Após incubação da noite para o dia 4 com soro Murino diluído em 1: 250, as placas foram lavadas de novo e, em seguida, incubadas durante 2 horas às 4 com anticorpos anti-IgM anti-MGM anti-MGM de coelho Biotin conjugados diluídos em 1 : 200. Subsequentemente, as placas foram lavadas e incubadas durante 2 horas a 4 com avidina marcada com peroxidase de rábano silvestre em diluição de 1 : 200. As placas foram então lavadas novamente, e 100 L de substrato —tetrametilbenzidina (TMB) e Solução de peróxido de hidrogênio foram adicionados aos poços por 30 minutos a 37. A reação foi terminada pela adição de 50 L de 2 M H2SO4 por Poço. A intensidade da cor amarela foi lida a 490 nm em um leitor de microplacas. Os SOROS de outros oito ratos BALB/c normais foram coletados e detectados ao mesmo tempo, e a densidade média e SD foram calculados para servir como controle. Os índices enzimáticos médios (IE) das amostras em diferentes grupos foram calculados como:

2.5. A cultura de células do baço e a indução da citoquina

cultura de células do baço e a indução das citoquinas foram modificações dos métodos descritos em . Resumidamente, as suspensões de células únicas foram preparadas a partir de baços removidos assepticamente de ratinhos e cultivadas em placas de cultura de 24 alvéolos a uma concentração final de células/ml. As células foram cultivadas em RPMI-1640, complementadas com 10% de soro de feto, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 50 m 2-mercaptoetanol e 10 ml de penicilina, estreptomicina e solução antimicótica/L (Sigma). As culturas foram estimuladas com 3 mg/L de ConA, 12 mg/L de LPS, ou apenas com meio e incubadas a 37 em ar humidificado com 5% de CO2. O sobrenadante foi colhido às 48 horas e conservado às 20 horas para os ensaios com citoquinas.

2.6. Citocina Ensaios

As concentrações de interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-13 (IL-13) no sobrenadante foram determinados usando comercial adequado ELISAs para o murino formulário destas citocinas. A intensidade de cada amostra foi lida a 450 nm em um espectrofotômetro de microplaca.

2.7. As técnicas histopatológicas

os rins colhidos durante o sacrifício dos ratinhos foram fixados durante 24 horas em formalina tamponada neutra antes da incorporação da parafina. As secções foram manchadas com hematoxilina, eosina e metenamina de prata de Jones e, em seguida, examinadas ao microscópio à luz para determinar a gravidade da lesão renal. Foi observado glomerulonefrite, lesões tubulares renais e inflamação intersticial, e o grau de gravidade das lesões histológicas características da nefrite lúpica foi avaliado como ausente (), ligeira (), moderada () e grave ().

2.8. A análise estatística

os resultados foram expressos como SD. A análise estatística foi realizada usando o teste T de dois sentidos do aluno com o nível mínimo de significância

3. Resultados

3.1. Efeitos da melatonina nos níveis de IgM Anti-ssDNA e de anticorpos histona em soro

os níveis de IgM anti-ssDNA e de anticorpos histona foram significativamente diferentes entre os grupos de tratamento com pristano-injecção e melatonina (Figuras 1 A) e 1 b)).

(a)

b)

(a)
b)

Figura 1

Os soros de ratos de cada grupo foram coletadas antes do tratamento (0), 2, 4 e 8 semanas depois, e os níveis de IgM anti-ssDNA e Antihistone anticorpos foram detectados por ELISA. O EI foi calculado de acordo com a fórmula. a) o nível de anticorpos IgM anti-ssDNA em cada grupo, B) o nível de anticorpos IgM anti-histamínicos em cada grupo. Os dados foram dados em média±DP (n=6-8). P * <.05, P* * <.01 versus sera a 0 wk, ∆P <.05,∆p <.01 contra sera em ratos de controlo de modelos.

Duas semanas após uma única injeção intraperitoneal de pristane, o nível de anti-ssDNA anticorpos IgM em soro começou a aumentar, obviamente, atingiu o pico de 4 wk, em seguida, começou a diminuir, e finalmente voltou ao normal em 8 semanas. No grupo MT1, o nível de anticorpos anti-ssDNA IgM no sera também aumentou e atingiu o pico em 4 wk, mas depois diminuiu mais obviamente em comparação com o grupo de controle model (). No grupo MT2, o nível de anticorpos anti-ssDNA IgM no soro aumentou durante as primeiras quatro semanas, mas muito inferior ao do Grupo Modelo (), e permaneceu normal em outros períodos. No grupo MT3, o nível de anticorpos IgM anti-ssDNA não aumentou [Figura 1 (a)].

anticorpos anti-Histónicos no soro aumentaram 1 wk após a injecção, atingiram o pico aos 4 wk, diminuíram gradualmente e voltaram ao normal aos 8 wk. No grupo MT1, os níveis de anticorpos anti-Histónicos no soro foram significativamente inferiores aos do grupo de controlo modelo () e voltaram ao normal a 4 wk. Nos grupos MT2 e MT3, os níveis de anticorpos aumentaram durante as primeiras quatro semanas, mas muito inferiores ao Grupo Modelo (), e permaneceram normais nos outros períodos (Figura 1(b)).

3.2. Efeitos da melatonina na produção de citocinas

para obter uma melhor compreensão da influência da melatonina nas citocinas na les, a produção de citocinas do tipo Th1 e Th2 por esplenócitos estimulados com ConA ou LPS foi avaliada durante o processo do lúpus Murino. Os resultados mostraram que a produção de IL-2, IL-6 e IL-13 se alterou nos ratos les induzidos pelo pristano (Figura 2). A produção de esplenócitos IL-2 de ratinhos no grupo de controlo model foi inferior à produção de ratinhos normais (), enquanto a produção de esplenócitos IL-6 e IL-13 de ratinhos no grupo de controlo model foi superior à produção de ratinhos normais (). Nos grupos MT2 e MT3, os níveis IL-2 foram até o nível normal e mais elevados do que o dos ratos modelo obviamente (), enquanto os níveis IL-6 e IL-13 foram inferiores ao dos ratos modelo obviamente (,) (Figura 2).

(a)

b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

Todos os ratos foram sacrificados ao final de 24 semanas, e esplênica linfócitos foram semeadas em 1×106 células/poço. As concentrações de IL-2 nos linfócitos esplénicos foram estimuladas durante 48 h com 3 mg/L de ConA. As concentrações de IL-6 e IL-13 nos linfócitos esplénicos foram estimuladas durante 48 h com 12 mg/L LPS. ELISA detectou concentrações de IL-2, IL-6 e IL-13 em sobrenadantes de culturas. Os dados foram dados em média± DP (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 versus grupo de controlo Normal, ∆P <.05, ∆p <.01 versus grupo de controlo de modelos.

3.3. Os efeitos da melatonina nas alterações histopatológicas renais

as alterações histopatológicas renais dos ratinhos são apresentadas na Tabela 1 e na Figura 3.

(a)

b)

(c)

d)

(a)
(b)
(c)
d)

Figura 3

Os rins coletados no momento do sacrifício foram coradas com H&E para o exame histológico. a) Grupo de controlo Normal (HE×200). b) Grupo de controlo do modelo (HE×200). c) grupo de controlo do modelo (HE×400). d) grupo MT (HE×200).

como demonstrado na Figura 3 (a), não foram observadas anomalias renais em ratinhos normais. O volume e o número de células do glomeruli estavam normais. A parede capilar Glomerular era fina. Não se viu nenhum molde de proteína no túbulo. Não se observaram infiltrações de linfócitos e proliferação de fibroblastos no intersticial renal.

tal como demonstrado nas Figuras 3(b) e 3(C) e no quadro 1, a maioria dos ratinhos com injecção de pristano revelou anomalias renais que variavam de padrões ligeiros a graves. Alguns glomérulos mostraram atrofia glomerular com dilatação capilares e espessamento das paredes capilares. Alguns cites revelaram formação de trombos. Observou-se também a ampliação Mesangial e o aumento das camadas celulares. A parede da cápsula Glomerular era espessa, e o espaço entre a parede da cápsula e as células endoteliais desapareceu em glomérulo severamente afetado. Alguns túbulos renais mostraram dilatação e proliferação das células epiteliais. Os moldes de proteínas foram vistos no túbulo. Observou-se uma infiltração de células inflamatórias, tais como monócitos, linfócitos e plasmacitos com Agregação focal, no intersticial renal. Foram também observadas proliferações de fibroblastos intersticiais.

registaram-se algumas melhorias de graus diferentes nos ratinhos tratados com melatonina (Figura 3(d) e Quadro 1). A atrofia Glomerular e o espessamento das paredes capilares foram alterados para um grau ligeiro ou moderado. O alargamento Mesangial também foi melhorado. O espaço entre a parede da cápsula e as células endoteliais era menor do que o dos ratinhos normais, mas verificou-se uma melhoria em comparação com o grupo de modelos não tratados. Observou-se também uma ligeira infiltração de linfócitos. Alguns túbulos renais mostraram dilatação ligeira e alguns moldes proteicos. No entanto, todas as alterações foram menos graves do que as registadas em ratos-modelo.

4. Discussão

neste estudo foram observados os distúrbios imunológicos de ratinhos com pristano e os efeitos da melatonina. Uma vez que os anticorpos anti-ADN e histona eram sensíveis na les , investigámos as alterações dos anticorpos anti-SVM anti-ssDNA e anti-histamínicos e detectámos níveis elevados de auto-anticorpos nos ratinhos com injecção de pristano. Foram também encontradas lesões renais nos ratinhos. Estes resultados foram consistentes com os relatórios anteriores. Também descobrimos que a melatonina antagonizava os níveis crescentes de IgM anti-ssDNA e auto-anticorpos histona, e a melatonina podia diminuir as lesões renais causadas pelo pristano. O Pristane é irritante peritoneal. É bem conhecido que a classe IgM é produzida pelo subconjunto de células B1 (CD5+), e o subconjunto B1 é altamente enriquecido na cavidade peritoneal e é expandido em ratos BALB/c , aumentando a possibilidade de que IgM anti-ssDNA e anticorpos anti-Histônicos induzidos por I. p.pristano são derivados do subconjunto. Estudos anteriores relataram que a melatonina teve efeitos na primeira resposta imunitária aos anticorpos (IgM, IgG) . Alguns estudos indicaram que a melatonina tinha modulação bidirecional em linfócitos . Então pensamos que a melatonina poderia melhorar os sintomas da les modulando a superprodução das células B.

a rede de citoquinas desempenha um papel importante no desenvolvimento da les. Em algumas experiências in vitro, a melatonina pode inibir os efeitos imunológicos de algumas citocinas e linfócitos T. Então observamos os efeitos da melatonina na perturbação da rede de citocinas. A IL-6 é considerada uma citocina inflamatória que é secretada por uma variedade de células do tecido, incluindo macrófagos e células-T2. O nível IL-6 tem uma correlação positiva com o índice de actividade do les. Os nossos resultados mostraram que o nível de IL-6 aumentou após a injecção de pristano, enquanto a melatonina pode diminuir a produção de IL-6. O nível crescente de IL-6 pode causar células B a secretar mais anticorpos e promover o desenvolvimento de nefrite . Assim, a redução da produção de IL-6 pela melatonina é útil para inibir a produção de anticorpos e as lesões renais.

IL-2 é secretado pelas células Th1 e IL-13 é secretado pelas células Th2. Há alguns resultados contraditórios nos documentos sobre as alterações da IL-2 e IL-13. Então, neste modelo de Les induzido por pristano, investigamos os níveis das duas citocinas. Os nossos resultados revelaram que o nível de IL-2 nos ratos com injecção de pristano era inferior ao dos ratos normais, enquanto o nível de IL-13 nos ratos com injecção de pristano era superior ao dos ratos normais. Também descobrimos que a melatonina poderia diminuir a produção IL-13, mas aumentou a produção IL-2. Muitos relatórios mostraram que o nível de IL-2 diminuiu na les, especialmente no estágio ativo, e que IL-2 poderia diminuir a ativação dos linfócitos B. Algumas pesquisas mostraram que a melatonina poderia regular o nível de receptores IL-2/IL-2 , que pode ser o mecanismo da ação inibitória da melatonina na produção IL-2. Il-13, uma das citocinas mais importantes no lúpus, acreditava-se ser um fator de ativação de células B que resultou na produção excessiva de muitos auto-anticorpos . A IL-13 tem relação com as lesões renais da les . Assim, a redução da produção de IL-13 pela melatonina também é útil na inibição da produção de anticorpos e lesões renais.

o nível decrescente de citocina do tipo Th1 e os níveis crescentes de citocina do tipo Th2 também indicaram que houve uma mudança de Th1 para Th2 no lúpus induzido pela Pristina. Alguns relatórios mostraram que a melatonina exógena poderia ativar as células T e promover significativamente as citocinas do tipo Th1, que participam na regulação dos distúrbios imunológicos . Os nossos resultados mostraram que a melatonina pode aumentar as citocinas do tipo Th1 e reduzir as citocinas do tipo Th2. E isso indicou que a melatonina poderia modular a perturbação da rede de citocinas nos ratos les regulando o desequilíbrio de Th1/Th2.

prednisona , que é uma droga comum para Les, foi servida como a droga positiva neste estudo. Descobrimos que a prednisona teve um efeito regulador na les induzida pelo pristano. Comparado com a prednisona, a melatonina teve um efeito semelhante ou um pouco anterior sobre os sintomas da les. Como sabemos, as reacções adversas da prednisona são mais frequentes e graves do que a melatonina. Assim, pensamos que a melatonina pode ser uma droga potencial para a les.

em conclusão, o lúpus induzido pelo pristano apresenta perturbações no sistema imunitário, tais como um elevado nível de auto-anticorpos e desequilíbrio da rede de citoquinas, que induz a nefrite seguida. As alterações são semelhantes ao lúpus humano, e o pristano é comum no ambiente; assim, este modelo é apropriado para estudar os efeitos da melatonina no Les relacionado com o ambiente. Por outro lado, também demonstrámos que a administração de melatonina inibiu as alterações no lúpus induzido pelo pristano. E isso sugere que a melatonina teve um efeito benéfico no lúpus relacionado com o ambiente. Os mecanismos podem envolver sua modulação de distúrbios no sistema imunológico, especialmente na rede de citocinas. No entanto, deverão ser necessários mais estudos para uma melhor compreensão do processo regulador e do factor-chave para a sua acção em matéria de doenças auto-imunes.