testul ELISA produce trei tipuri diferite de date de ieșire:
cantitative
datele Elisa pot fi interpretate în comparație cu o curbă standard (o diluție în serie a unui antigen cunoscut, purificat) pentru a calcula cu precizie concentrațiile de antigen în diferite probe (Figura 6).
calitativ
ELISAs poate fi, de asemenea, utilizat pentru a obține un răspuns da sau nu care să indice dacă un anumit antigen este prezent într-o probă, în comparație cu un puț martor care nu conține antigen sau un antigen de control fără legătură.
semi-cantitativ
ELISAs poate fi utilizat pentru a compara nivelurile relative de antigen în probele de testare, deoarece intensitatea semnalului va varia direct în funcție de concentrația antigenului.
curba Standard
datele ELISA sunt de obicei graficate cu densitate optică vs concentrație log pentru a produce o curbă sigmoidală așa cum se arată în Figura 6. Concentrațiile cunoscute de antigen sunt utilizate pentru a produce o curbă standard și apoi aceste date sunt utilizate pentru a măsura concentrația probelor necunoscute prin comparație cu porțiunea liniară a curbei standard. Acest lucru se poate face direct pe grafic sau cu software-ul de montare a curbei, care se găsește de obicei pe cititoarele de plăci ELISA.
Fig. 6. O curbă standard tipică ELISA.
modele de curbe de calibrare
dacă este necesar un rezultat cantitativ, cel mai simplu mod de a proceda este de a media triplicatul citirilor standardelor și de a deduce citirea eșantionului martor martor. Apoi, trasați curba standard, găsiți linia cea mai potrivită sau cel puțin trageți o curbă punct la punct, astfel încât concentrația probelor să poată fi determinată. Orice diluție făcută trebuie ajustată în acest stadiu. Aceasta este, în general, măsura practică în care se poate lua calculul manual.
o variație este de a trasa datele folosind semi-log, log/log, log/logit și derivatele sale – modelele logistice cu 4 sau 5 parametri. Utilizarea soluțiilor bazate pe software / automate face posibilă luarea în considerare a abordărilor grafice mai sofisticate. Utilizarea regresiei liniare într-un pachet software adaugă mai multe posibilități de verificare; este posibil să verificați valoarea R2 pentru a determina bunătatea generală a potrivirii. Pentru acea porțiune a curbei în care relația dintre concentrație și citire are o relație liniară, valorile R2 >0,99 reprezintă o potrivire foarte bună. Precizia poate fi apoi îmbunătățită în continuare prin utilizarea unor concentrații standard suplimentare în acest interval.
un aspect al graficului liniar este că comprimă punctele de date pe concentrațiile mai mici ale curbei standard, făcând astfel intervalul cel mai precis (zona cea mai probabilă pentru a atinge valoarea R2 necesară). Pentru a contracara această compresie poate fi utilizată o diagramă semi-jurnal; aici Jurnalul valorii concentrației (pe axa x) este reprezentat grafic împotriva citirii (pe axa y). Această metodă oferă o curbă de date în formă de S care distribuie mai multe puncte de date în modelul sigmoidal mai ușor de utilizat.
tipul de grafic log/log (log of concentration against log of readout) reușește să liniarizeze mai mult din curba de date. Intervalul de concentrație standard scăzut până la mediu este în general liniar în acest model, doar capătul superior al intervalului tinde să se înclină. Log / logit și derivatele sale, modelele logistice cu 4 sau 5 parametri, sunt mai sofisticate, necesitând calcule și estimări mai complexe ale valorilor max, min, EC50 și pantei. Modelul parametrilor 5 necesită în plus valoarea asimetriei.
în timp ce aceste modele de curbe de calibrare pot oferi performanțe îmbunătățite, un bun punct de plecare ar fi utilizarea graficului jurnal-jurnal cu o verificare a procentului de recuperare (Recuperarea analitului din probele cu vârfuri). În mod alternativ, cel puțin’ potrivirea înapoi ‘a valorilor standard de citire a curbei este adesea o abordare suficient de bună. Cel mai simplu mod de a verifica este să calculați înapoi standardele de calibrare și să verificați dacă acestea se încadrează în 20% din valoarea nominală de citire. Un avertisment este să nu vă bazați pe valorile R2’ bune ‘ și să găsiți acel model de curbă de calibrare care oferă cele mai bune valori de recuperare pentru standarde.
sensibilitate ELISA
Elisa este unul dintre cele mai sensibile teste imunologice disponibile. Intervalul tipic de detecție pentru un ELISA este de 0,1 până la 1 fmol sau 0,01 ng până la 0,1 ng, sensibilitatea depinzând de caracteristicile particulare ale interacțiunii anticorp-antigen. În plus, unele substraturi, cum ar fi cele care produc semnal chemiluminescent sau fluorescent îmbunătățit, pot fi utilizate pentru a îmbunătăți rezultatele.
așa cum am menționat mai devreme, detectarea indirectă va produce niveluri mai ridicate de semnal și, prin urmare, ar trebui să fie mai sensibilă. Cu toate acestea, poate provoca, de asemenea, un semnal de fundal mai mare, reducând astfel nivelurile de semnal specifice nete.