Antivenom effekter av 1,2,3-triazoler mot Bothrops jararaca och Lachesis muta ormar

Abstrakt

Ormgiftar är komplexa blandningar av proteiner av både enzymer och nonenzymer, som är ansvariga för att producera flera biologiska effekter. Mänsklig envenomation av ormbett, särskilt de hos viperidfamiljen, inducerar en komplex patofysiologisk bild som kännetecknas av spektakulära förändringar i hemostas och ofta blödning ses också. Föreliggande arbete rapporterar förmågan hos sex av en serie av 1,2,3-triazolderivat att hämma vissa farmakologiska effekter orsakade av gift av Bothrops jararaca och Lachesis muta. In vitro-analyser visade att dessa föreningar försämrades på ett koncentrationsberoende sätt, fibrinogen eller plasmakoagulation, hemolys och proteolys producerad av båda venomerna. Dessutom hämmade dessa föreningar biologiska effekter in vivo också. Möss behandlade med dessa föreningar skyddades fullständigt från hemorragiska skador orsakade av sådana gifter. Men bara B. jararaca-ödem-inducerande aktivitet neutraliserades av triazolerna. Så den hämmande effekten av triazolderivat mot vissa in vitro och in vivo biologiska analyser av ormgiftar pekar på lovande aspekter som kan indikera dem som molekylära modeller för att förbättra produktionen av effektivt motgift eller för att komplettera motgift neutralisering, särskilt de lokala patologiska effekterna, som delvis neutraliseras av motgift.

1. Inledning

Ormgiftar är komplexa blandningar av proteiner inklusive enzymer (metalloproteinaser, serinproteinaser, fosfolipaser A2 och L-aminosyraoxidas) och proteiner utan enzymatisk aktivitet, såsom sönderfall, lektiner av C-typ, cysteinrika sekretoriska proteiner (skarpa) toxiner, natriuretiska peptider och myotoxiner. De giftiga gropvipersna Bothrops jararaca och Lachesis muta är ansvariga för olyckor med människor i flera regioner i Sydamerika. Medan B. jararaca finns i södra Brasilien, Paraguay, och norra Argentina, L. muta distribueras i ekvatorialskogarna öster om Anderna, allt från östra Ecuador, Colombia, Peru, norra Bolivia och östra och norra Venezuela, till Guyana, Franska Guyana, Surinam och norra Brasilien. Inom deras räckvidd är de ofta rikliga och är viktiga orsaker till ormbett . Envenoming av dessa ormar kännetecknas huvudsakligen av systemisk (generaliserad blödning, koagulopati, njursvikt och chock) och lokala effekter (blödning, ödem och nekros) . Som rapporterats någon annanstans utgör ormbett ett folkhälsoproblem i Latinamerika och i andra tropiska och subtropiska länder, där de betraktas som en försummad hälsofråga, enligt Världshälsoorganisationen (WHO) . I Sydamerika inducerar B. jararaca en högre förekomst av bett (95%) än L. muta (cirka 2%); emellertid leder L. muta-bett vanligtvis till allvarligare envenoming-symtom och dess dödlighet är tre gånger högre än B. jararaca . Numera är parenteral administrering av animaliskt härledd antivenom den enda specifika behandlingen för envenoming av ormbett. I Brasilien används intravenös administrering av antingen Bothrops polyvalent antivenom för att behandla de envenoming fall som orsakas av Bothrops bites eller det polyvalenta bothropic-lachetic serum för L. muta och Bothrops (B. atrox) ormbett i Amazonas regioner. Som nämnts ovan kännetecknas måttliga till svåra envenomings som orsakas av Bothrops och Lachesis ormar av en komplex serie lokala och systemiska förändringar såsom blödning, myonekros, koagulopati, kardiovaskulär chock, njursvikt och så småningom död . Som rapporterats av andra författare, trots att de är säkra, kan höga doser av antivenomer som ibland används i Brasilien För att behandla patienter med beprövade eller misstänkta Bothrops/Lachesis envenoming bidra till tidiga anafylaktiska och sena reaktioner (serumsjukdom). Således utgör produktionen av antivenomer av tillräcklig kvalitet en stor utmaning. Dessutom har priserna på antivenomer ökat och vissa länder har slutat sin tillverkning . Vissa antivenomer neutraliserar effektivt de systemiska toxiska effekterna av giftet; de lokala effekterna blockeras emellertid inte och denna situation kan leda till amputation eller funktionshinder .

på grund av sådana problem har alternativa behandlingar sökts och några av dem har involverat sökandet efter nya molekyler som kan neutralisera systemiska och lokala effekter av gifter. Extrakt från växter och andra naturliga källor (som de från marina organismer) har testats för deras förmåga att neutralisera en mängd biologiska och toxiska effekter av ormgiftar. Olika farmakologiskt aktiva molekyler har identifierats , och många effekter har redan listats för dem, inklusive deras antivenomförmåga . Numera undersöks många nya bioprospecting-metoder. I samband med detta bör det dock noteras att de biologiska effekterna av molekyler som härrör från organisk syntes ännu inte har undersökts väl. Litteraturen har beskrivit 1,2,3-triazolförening som en viktig klass av fem-medlems kväve heterocykliska system som uppvisar olika farmakologiska profiler, såsom trombocytaggregationshämmande aktivitet , anticlotting , antiviral , trypanocidal , antimikrobiell , och/eller deras användning vid behandling av schizofreni och leishmaniasis . Två allmänna metoder är tillgängliga för konstruktion av 1,2,3-triazolringar: Huisgen 1,3-dipolära cykloadditionsreaktioner , i synnerhet koppar(i)-katalyserad cykloaddition och den intramolekylära 1,5-elektrocykliseringen av de substituerade-diazokarbonylföreningarna av typ av typ . Våra tidigare studier har visat att sex nya syntetiska 1,2,3-triazolföreningar (1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboxylsyraetylestrar) hämmade hemolysen inducerad av L. muta gift . Faktum är att sådana derivat visade ett brett spektrum av farmakologiska aktiviteter .

syftet med detta arbete var att utvärdera förmågan hos dessa sex 1,2,3-triazolderivat baserade på –1-(p-klorfenyl)-1h–triazol-4-karbohydrazid mot In vivo och in vitro-aktiviteter av Bothrops jararaca och Lachesis muta venoms.

2. Material

2.1. Gift och Material

Bothrops jararaca, Lachesis muta lyofiliserade venomer och anti-Lachesis eller anti-Bothropic antivenom tillhandahölls från Funda Jacobo Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasilien och lagrades vid -20 acuc C tills analyser. Dimetylsufoxid (DMSO), bovint fibrinogen och azokasein erhölls från Sigma Chemical Co. Alla andra reagenser var av bästa tillgängliga kvalitet.

2.2. Syntetiska derivat

de sex 1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboxylsyraetylesterderivat syntetiserades enligt vår tidigare rapport och deras kemiska strukturer visas i Figur 1. Dessa föreningar löstes upp i dimetylsufoxid (DMSO) och lagrades vid 4 msk C tills det krävdes.

Figur 1

kemiska strukturer av de sex 1,2,3-triazolderivaten N ’ – 1-(p-klorfenyl)-1h-triazol-4-karbohydrazid. De sex derivaten utformades som siffror, som visas i parentesen efter varje derivat.

2.3. Djur

BALB/c-möss (18-20 g) erhölls från N Askorcleo de Animais de laborat Oguirio (NAL) vid Federal Fluminense University. Djuren var inrymda under kontrollerade temperaturbetingelser (kub C) och ljus. Experiment godkändes av UFF Institutional Committee for Ethics in Animal Experimentation (protokoll nummer 297) som överensstämde med riktlinjerna från Brazilian Committee for Animal Experimentation (COBEA) och internationella lagar och policyer.

3. Metoder

3.1. Hämning av indirekt hemolys

graden av hemolys orsakad av venomerna av L. muta och B. jararaca bestämdes av det indirekta hemolytiska testet med användning av humana erytrocyter och höns äggula emulsion som substrat . Mängden L. muta och B. jararaca-gift (USC/mL) som producerade 100% hemolys betecknades som minsta indirekta hemolytiska dos (MIHD). Hämmande experiment utfördes genom inkubering av triazolderivat med en MIHD i 30 minuter vid rumstemperatur och därefter utvärderades hemolytisk aktivitet. Kontrollexperiment gjordes genom inkubering av gift med DMSO eller saltlösning.

3.2. Antiklottningsaktivitet

koagulationsaktiviteten För L. muta och B. jararaca venoms bestämdes med användning av en digital Amelung-koagulometer, modell KC4A (Labcon, Tyskland). Olika koncentrationer av L. muta (10 kg/mL) och B. jararaca (40 kg/mL) gift blandades med bovin fibrinogenlösning (2 mg / mL) eller med human plasma, och mängden gift som koagulerade antingen fibrinogen eller plasma på 60 sekunder betecknades som minsta koaguleringsdos (MCD). För att utvärdera deras hämmande effekt inkuberades triazolderivaten i 30 minuter vid rumstemperatur med en MCD av venomer, och sedan tillsattes blandningen till fibrinogen eller plasma och koagulationstid registrerades. Kontrollexperiment utfördes parallellt genom tillsats av DMSO eller saltlösning inkuberad med gift, istället för triazolerna.

3.3. Antiproteolytisk aktivitet

proteolytisk aktivitet av L. muta och B. jararaca venoms bestämdes med användning av azokasein som substrat (0,2% w/v, i 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), med mindre modifiering . En effektiv koncentration (EC) definierades som den mängd gift (Aci/mL) som kunde producera en variation vid en 420 nm av ca 0,2. Triazolderivat inkuberades med en EG av gift i 30 minuter vid rumstemperatur och därefter mättes proteolys. Kontrollexperiment gjordes genom inkubering av gift med DMSO eller saltlösning.

3.4. Antihemorragisk aktivitet

hemorragiska lesioner producerade av L. muta och B. jararaca venoms kvantifierades med användning av ett förfarande som beskrivs av Kondo et al. , med modifieringar. I korthet injicerades prover intradermalt (i.d.) i musens bukhud. Två timmar senare avlivades djuren genom halshuggning, bukhuden avlägsnades, sträcktes och inspekterades för visuella förändringar i den inre aspekten för att lokalisera hemorragiska fläckar. Blödning kvantifierades som den minsta hemorragiska dosen (MHD), definierad som mängden gift (mg/kg) som kan producera en hemorragisk halo på 10 mm. Den hämmande effekten av triazolderivat undersöktes genom inkubering av föreningar med två MHD av L. muta eller B. jararaca-gift i 30 minuter vid rumstemperatur och sedan injicerades blandningen i möss och blödning mättes. Hemorragisk aktivitet uttrycktes som medeldiametern (i millimeter) av den hemorragiska haloen inducerad av gifter i frånvaro och närvaro av triazolderivaten. Negativa kontrollexperiment utfördes genom att injicera DMSO eller saltlösning.

3.5. Antiedematogen aktivitet

ödem-inducerande aktivitet av L. muta och B. jararaca venoms bestämdes enligt Yamakawa et al. , med modifieringar. Grupper av fem möss injicerades subkutant (s. c)i höger fotkudde med 50 oc gift, medan den vänstra matkudden fick 50 oc salt. En timme efter injektionen utvärderades ödem och uttrycktes som procentuell ökning av vikten på den högra fotplattan jämfört med den vänstra. Den hämmande effekten av triazolderivat undersöktes genom inkubering av föreningar med L. muta eller B. jararaca-gift i 30 minuter vid rumstemperatur och sedan injicerades blandningen i möss (höger fotkudde) och ödem mättes.

3.6. Statistisk analys

resultaten uttrycks som medel som erhållits med det angivna antalet djur eller experiment som utförts. Den statistiska signifikansen av skillnader mellan experimentella grupper utvärderades med hjälp av studentens-test. Ett värde på 0,05 0,05 ansågs betydande.

4. Resultat och diskussion

utvecklingen av effektiva, säkra, billigare och mer tillgängliga antivenoms förtjänar uppmärksamhet, eftersom ormbett kan orsaka allvarliga funktionshinder och döda tusentals människor också. Ett växande antal studier har fokuserats på sökandet efter hämmare av ormgiftar från olika källor, vare sig de är naturliga eller syntetiska . Suramin och bensoylfenylbensoat är syntetiska molekyler som kan hämma myotoxicitet, koagulering och fosfolipas A2 och hyaluronidas aktiviteter av ormgiftar från olika familjer. Laktonanaloger syntetiserades och inhiberades myotoxicitet och ödem-inducerande och enzymatiska aktiviteter inducerade av ett fosfolipas A2 isolerat från B. jararacussu antingen . Å andra sidan har Marina bioaktiva principer också väckt uppmärksamhet på grund av deras breda farmakologiska åtgärder .

i detta arbete utvärderades förmågan hos sex 1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboxylsyraetylestrar att neutralisera vissa in vitro (hemolys, koagulering och proteolys) och in vivo (blödning och ödem-inducerande) aktiviteter orsakade av B. jararaca och L. muta venoms, eftersom tidigare resultat indikerade att dessa sex derivat hämmade hemolys inducerad av L. muta venom, men med olika förmågor . Av denna anledning trodde man att det skulle vara värt att undersöka åtgärderna för sådana derivat på andra viktiga biologiska aktiviteter relaterade till ormbett, som proteolys, koagulering, hemolys, blödning och ödem. Det visade sig att dessa föreningar inhiberade hemolysen orsakad av B. jararaca (50 kg/mL) och L. muta (15 kg/mL) gift (Figur 2(a)). Den hämmande procentandelen av derivaten var över 50% mot båda venomerna. En liten skillnad på den hämmande profilen observerades emellertid för derivat 6, där en 50% och 90% hämning på hemolys uppnåddes för B. jararaca respektive L. muta-gift. Varken derivat eller DMSO ledde erytrocyter till hemolys, och DMSO störde inte heller graden av hemolys orsakad av gifter.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

effekt av derivat på hemolys och proteolys. Derivat 1-6 (45 occurm) inkuberades med B. jararaca (mörka kolumner) eller Med L. muta (streckade kolumner) i 30 minuter vid rumstemperatur och därefter utfördes hemolytiska (a) och proteolytiska (b) aktiviteter. Data uttrycks som genomsnittlig sem för enskilda experiment ().

Envenomation av dessa ormbett ger allvarlig blödning på grund av det höga innehållet av zinkberoende metalloproteas eller serinproteas som smälter proteinkomponenter i den extracellulära matrisen eller konsumerar blodkoagulationsfaktorer . B. jararaca och L. muta-gift hydrolyserat azokasein på ett koncentrationsberoende sätt med en EG på 20 kg / mL respektive 6 kg/mL (data visas inte). Derivaten inhiberade proteolys inducerad av B. jararaca eller L. muta (Figur 2(b)). Derivaten 1, 2, 3 och 6 inhiberade proteolys inducerad av båda venomerna upp till 80% och derivatet 5 inhiberade en sådan aktivitet under 50%. En markant skillnad på hämmande profil av derivat observerades för derivat 4, där det hämmade 97% och 25% proteolysen inducerad av B. jararaca respektive L. muta-gift (Figur 2(b)).

som framgår av Figur 3 hämmade derivaten 1, 2, 4, 5 och 6, men inte derivatet 3 på ett koncentrationsberoende sätt (23-94 kg), koaguleringen av fibrinogen inducerad av venomerna av B. jararaca (40 kg/mL) eller L. muta (10 kg/mL). Det verkade som derivat hämmade mer effektivt L. muta-inducerande koagulering än B. jararaca. Vid den högsta koncentrationen (94 kg) förhindrade derivaten 1, 2, 3, 5 och 6 L. muta-koagulering (Figur 3(b)), medan derivaten 2 och 6 förhindrade B. jararaca en gång (Figur 3(b)). Vid koncentrationer upp till 200 kg förhindrade alla 1,2,3-triazolderivat effektivt fibrinogenkoagulation orsakad av båda venomerna, men vid koncentrationer under 10 kg förhindrade ingen av dessa föreningar koagulering. Emellertid, när derivat (10 mic) sattes ihop och inkuberades med antingen B. jararaca eller L. muta venom, fördröjdes koagulationstiden två gånger. Det noterades att om derivat 2 eller 6 avlägsnades från blandningen observerades inte hämmande effekt vid koagulering. Dessutom förhindrade derivaten också koagulering inducerad av gifter när plasma användes. Varken DMSO (1% v/v, slutlig koncentration) eller saltlösning störde koagulationsprocesser.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

effekt av derivat på fibrinogenkoagulering. Tjugotre sacribm-derivat (grå kolumner), 46 sacribm (vita kolumner) eller 94 sacribm (svarta kolumner) inkuberades med 40 sacribg/mL B. jararaca (A) eller med 10 sacribg/mL L. muta (b) i 30 minuter vid rumstemperatur. Därefter tillsattes blandningen till fibrinogen (2 mg/mL) och koagulationstiden registrerades. Gift inkuberades med saltlösning (C1); 1% v/v DMSO (C2); derivat 1 (Kolumn 1); derivat 2 (kolumn 2); derivat 3 (kolumn 3); derivat 4 (kolumn 4); derivat 5 (kolumn 5); och med derivat 6 (kolumn 6). # betyder att fibrinogen inte koagulerade förrän 600 sekunders observation. Data uttrycks som genomsnittlig sem för enskilda experiment ().

Intradermal injektion av B. jararaca (12 mg/Kg) eller L. muta (20 mg/Kg) gift gav en blödningshalo på 20 mm hos möss. En sådan halo representerar två MHD av gifter. När varje gift blandades med derivat (90 mic) och sedan injicerades i möss sågs ett fullständigt skydd mot blödning (data visas inte). Däremot visade tidigare resultat att antilaquetiskt serum inte inhiberade blödning inducerad av L. muta venom . Injektion av DMSO, derivat eller saltlösning gav inte blödning. Ödem-inducerande är en annan viktig effekt som följer ormbett . Figur 4 visar att ödem inducerat av 5 mg / Kg B. jararaca(Figur 4 (a)) eller 8 mg/Kg L. muta(Figur 4 (B)) reducerades signifikant av derivaten (90 kcal). Triazolderivaten 1, 2 och 4 hämmade över 80% det ödem som inducerades av B. jararaca, medan derivat 3, 5 och 6 hämmade omkring 70% (Figur 4(A)). Som sett hämmade alla derivat mindre L. muta-inducerad edematogen aktivitet(Figur 4 (b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

effekt av derivat på ödem-inducerande aktivitet. Derivaten (90 mic) inkuberades med 5 mg / Kg B. jararaca (a) eller med 8 mg/Kg L. muta (b) i 30 minuter vid rumstemperatur och därefter utfördes ödeminducerande aktivitet. Kolumner är derivat 1 plus Gift (1); derivat 2 plus Gift (2); derivat 3 plus Gift (3); derivat 4 plus Gift (4); derivat 5 plus Gift (5) och derivat 6 plus Gift (6). Data uttrycks som genomsnittlig sem för enskilda experiment ().

Sammanfattningsvis kan 1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboxylsyraetylesterderivat vara användbara som prototyper för att utforma nya molekyler för att förbättra den nuvarande behandlingen som används för B. jararaca och L. muta ormbett. Den hämmande styrkan hos dessa derivat kan variera eller kan förbättras när de sattes ihop, förmodligen verkar synergistiskt. Således skulle en lägre koncentration av dem behövas för att nå en fullständig neutralisering av de biologiska effekterna orsakade av B. jararaca och L. muta venoms. Vidare har tidigare analys av struktur-aktivitetsförhållandet mellan derivat redan utförts . Derivaten överlämnades till analysen av” Lipinskis regel om fem ” som indikerar att en kemisk molekyl kan vara ett oralt aktivt läkemedel hos människor och en sådan regel säger att en molekyl som bryter mot två av följande regler sannolikt kommer att absorberas dåligt: (1) molekylvikt mindre än 500 Da, (2) Antal vätebindningsgivare (OH-eller NH-grupper) lika med eller mindre än 5, (3) Antal vätebindningsacceptorer mindre än 10 och slutligen (4) beräknat mindre än 5 . Resultaten visade att alla derivat uppfyllde denna regel (molekylvikt = 296.31–341.30; 2.6–3.4; nHBA = 8-11 och nHBD = 1-3) pekar på god teoretisk biodisponibilitet .

bekräftelser

detta arbete stöddes av International Foundation for Science (IFS Grant F/4571-1) och av följande brasilianska finansieringsorgan: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (slängkappor), och Universidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff/PROPPi).