rozvoj a postupné zlepšení droždí two-hybrid systém (Y2H) od počátku 90. let revoluci způsob, jakým protein interakcí by mohla být detected1.
Kvasnice two-hybrid je založen na rozpuštění funkční transkripční faktor (TF), když dva proteiny nebo polypeptidy zájem komunikovat. To se odehrává v geneticky upravené kmeny kvasinek, ve kterém transkripce reportér genu vede ke konkrétní fenotyp, obvykle růst na selektivním médiu nebo změny v barvě kvasinkových kolonií. Nejvíce populární reportér geny HIS3 vyberte droždí, a to na médiu chybí histidin, a LacZ na obrazovce droždí v kolorimetrické stanovení.
technické detaily Droždí Two-Hybrid Assay jsou uvedeny v karikatuře níže.
Dvě fúze („hybridy“) jsou konstruovány mezi každý protein zájmu, a to buď DNA vazebnou Doménu (DBD) nebo Aktivační Domény (AD) TF. Protein fúzovaný s DBD se označuje jako „návnada“ a protein fúzovaný s AD jako „kořist“.
Na interakce mezi návnady a kořist, DBD a AD jsou přivedeny v těsné blízkosti a funkční TF je rozpuštěn před reporter gene. Nejoblíbenější fúze používají DBD a AD kvasinek TF Gal4. Bakteriální protein LexA se také často používá jako DBD v kombinaci s Gal4 AD.
Jako genetická technika, droždí dvou-hybridní obrazovka nabízí citlivé a nákladově efektivní mysli vyzkoušet přímou interakci mezi dvěma cílené proteiny, nebo použít jeden oblíbený protein jako návnadu na obrazovce knihovny proteinů, fragmentů připravených z požadované typy buněk, tkání nebo celých organismů. Identita interagujících partnerů se pak získá sekvenováním odpovídajících plazmidů ve vybraných koloniích kvasinek. Kolekce plné délce proteiny (‚ORFeomes‘) jsou také stále k dispozici pro několik druhů, ale nemají pokrytí celého proteomu.
kvasnice two-hybrid systém byl rychle přijat do vědecké komunity a obrazovek v různých formách a oblastech výzkumu již vedl desítky tisíc publikací. Zůstává metodou volby, pokud jde o objevování nových interakcí proteinů, jak odráží nedávno publikovaná literatura.
Variace Y2H byly vyvinuty k provádění obrazovkách v přítomnosti co-faktor, nebo enzym nutný pro daný post-translační modifikace proteinu partners2.
jiné verze umožňují screening integrálních membránových proteinů3 a tato technika byla upravena pro detekci interakcí protein-protein v savčích buňkách4. Nakonec byly také navrženy kvasinkové n-hybridní protokoly pro screening nových interakcí DNA-protein5, RNA-protein6 a malých molekul-proteinů7.
Objevte Hybrigenics nejnovější optimalizovaná služba Dvouhybridních obrazovek kvasinek: ULTImate Y2H.
kontaktujte naše týmy vědců a získejte bezplatné rady ohledně vašeho projektu.
1. Fields, S. A Song, o. nový genetický systém pro detekci interakcí protein-protein (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. a Arpin, M. Prostorový nábor a aktivaci Fes kinázy tím, ezrin podporuje HGF-indukované buněčné rozptyl (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, i., Korostensky, C., Johnsson, N. A te Heesen, s. Genetický systém založený na split-ubiquitin pro analýzu interakce mezi membránové proteiny in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. a Tavernier, J. Návrh a aplikace cytokinů-receptor interakce založené na past (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, j. J. a Herskowitz, I. Izolace ORC6, součástí kvasinkového původu uznání komplexní-hybridní systém (1993) Věda 262(5141), 1870-1874
6. Putz, u., Skehel, P. a Kuhl, D. Tri-hybridní systém pro analýzu a detekci RNA–proteinových interakcí (1996) nukleové kyseliny Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. Liu, J. O. tři-hybridní systém pro detekci malých ligand-protein
receptor interakce (1996) PNAS 93(23), 12817-12821