O desenvolvimento e a gradual melhoria do fermento two-hybrid system (Y2H) desde o início dos anos 90, revolucionou a forma de proteína medicamentosas poderia ser detected1.
o híbrido duas leveduras é baseado na reconstituição de um factor de transcrição funcional (ft) quando duas proteínas ou polipeptídeos de interesse interagem. Isto ocorre em estirpes de levedura geneticamente modificadas, em que a transcrição de um gene repórter leva a um fenótipo específico, geralmente crescimento em um meio seletivo ou mudança na cor das colônias de leveduras. Os genes de repórter mais populares são HIS3 para selecionar levedura em um meio sem histidina, e LacZ para tela de levedura em um teste colorimétrico.
os pormenores técnicos de um ensaio híbrido de duas leveduras são descritos no desenho a seguir.
duas perfusões (“híbridos”) são construídas entre cada proteína de interesse e o domínio de ligação do ADN (DBD) ou o domínio de activação (AD) do TF. A proteína fundida ao DBD é referida como “isco” e a proteína fundida ao AD como “presa”.
após a interacção entre o isco e a presa, a DBD e a AD são trazidas para uma estreita proximidade e um TF funcional é reconstituído a montante do gene repórter. As perfusões mais populares usam o DBD e o AD da levedura TF Gal4. A proteína bacteriana LexA também é frequentemente usada como um DBD em combinação com Gal4 AD.Como técnica genética, uma tela híbrida de levedura de dois híbridos oferece uma média sensível e econômica para testar a interação direta entre duas proteínas direcionadas, ou para usar a proteína favorita de uma pessoa como isca para rastrear bibliotecas de fragmentos de proteínas preparadas a partir dos tipos de células desejadas, tecidos ou organismos inteiros. A identidade dos parceiros interagentes é então obtida sequenciando os plasmídeos correspondentes nas colónias de leveduras seleccionadas. Também estão disponíveis coleções de proteínas de comprimento total (“Orfeomas”) para várias espécies, mas ainda não cobrem todo o proteoma.O sistema híbrido duas leveduras foi rapidamente adotado pela comunidade científica e telas em várias espécies e campos de pesquisa já levaram a dezenas de milhares de publicações. Continua a ser o método de escolha quando se trata de descobrir novas interações proteicas, como refletido pela literatura recentemente publicada.
Variações de Y2H foram desenvolvidos a fim de realizar telas na presença de um co-fator, ou de uma enzima necessária para uma dada pós-translacional de modificação da proteína partners2.
outras versões permitem rastrear proteinas integrais de membrana 3 e a técnica foi adaptada para detectar interações proteína-proteína em células de mamíferos 4. Finalmente, protocolos n-híbridos de levedura também foram concebidos para rastrear novas interações DNA-protein5, RNA-protein6 e moléculas-proteinas7.
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1. Fields, S. and Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. and Arpin, M. Spatial recruitment and activation of the Fes kinase by ezrin promotes HGF-induced cell scattering (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N., te Heesen, S. Um sistema genético baseado na ubiquitina dividida para a análise de interações entre proteínas de membrana in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. and Tavernier, J. Design and application of a cytokine-receptor-based interaction trap (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, J. J. and Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the levedure origin recognition complex by a one-hybrid system (1993) Science 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. E Kuhl, D. A tri-hybrid system for the analysis and detection of RNA–protein interactions (1996) Nucleic Acids Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. and Liu, J. O. A three-hybrid system for detecting small ligand-protein
receptors interactions(1996) PNAS 93 (23), 12817-12821