dezvoltarea și îmbunătățirea treptată a sistemului de drojdie cu două hibrizi (Y2H) de la începutul anilor 90 au revoluționat modul în care interacțiunile proteice ar putea fi detectate1.
drojdia cu două hibrizi se bazează pe reconstituirea unui factor de transcripție funcțional (TF) atunci când interacționează două proteine sau polipeptide de interes. Acest lucru are loc în tulpini de drojdie modificate genetic, în care transcrierea unei gene reporter duce la un fenotip specific, de obicei creșterea pe un mediu selectiv sau schimbarea culorii coloniilor de drojdie. Cele mai populare gene reporter sunt HIS3 pentru a selecta drojdia pe un mediu lipsit de histidină și LacZ pentru a examina drojdia într-un test colorimetric.
detaliile tehnice ale unui test cu două hibrizi de drojdie sunt prezentate în desenul animat de mai jos.
două fuziuni (‘hibrizi’) sunt construite între fiecare proteină de interes și fie domeniul de legare a ADN-ului (DBD), fie Domeniul de activare (AD) al TF. Proteina fuzionată cu DBD este denumită ‘momeală’, iar proteina fuzionată cu AD ca ‘pradă’.
la interacțiunea dintre momeală și pradă, DBD și AD sunt aduse în imediata apropiere și un TF funcțional este reconstituit în amonte de gena reporter. Cele mai populare fuziuni folosesc DBD și AD ale drojdiei TF Gal4. Proteina bacteriană LexA este, de asemenea, frecvent utilizată ca DBD în combinație cu Gal4 AD.
ca tehnică genetică, un ecran cu două hibrizi de drojdie oferă un mijloc sensibil și rentabil pentru a testa interacțiunea directă dintre două proteine vizate sau pentru a folosi proteina preferată ca momeală pentru a examina bibliotecile de fragmente de proteine preparate din tipurile de celule dorite, țesuturi sau organisme întregi. Identitatea partenerilor care interacționează este apoi obținută prin secvențierea plasmidelor corespunzătoare în coloniile de drojdie selectate. Colecțiile de proteine de lungime întreagă (ORFeomes) devin, de asemenea, disponibile pentru mai multe specii, dar nu acoperă încă întregul proteom.
sistemul de drojdie cu două hibrizi a fost adoptat rapid de comunitatea științifică, iar ecranele din diferite specii și domenii de cercetare au condus deja la zeci de mii de publicații. Rămâne metoda de alegere atunci când vine vorba de a descoperi noi interacțiuni proteice, așa cum se reflectă în literatura publicată recent.
variațiile Y2H au fost dezvoltate pentru a efectua ecrane în prezența unui co-factor sau a unei enzime necesare pentru o anumită modificare post-translațională a partenerilor proteini2.
alte versiuni permit ecranizarea proteinelor membranare integrale3 și tehnica a fost adaptată pentru a detecta interacțiunile proteine-proteine în celulele mamiferelor4. În cele din urmă, protocoalele de drojdie n-hibrid au fost, de asemenea, concepute pentru a examina noile interacțiuni ADN-protein5, ARN-protein6 și molecule mici-proteine7.
descoperiți Hybrigenics cel mai recent serviciu optimizat de ecran cu două hibrizi de drojdie: ULTImate Y2H.
contactați echipele noastre de oameni de știință pentru sfaturi gratuite despre proiectul dvs.
1. Fields, S. și Song, O. un nou sistem genetic pentru detectarea interacțiunilor proteine-proteine (1989) natura 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. și Arpin, M. recrutarea spațială și activarea kinazei Fes de către ezrin promovează împrăștierea celulelor induse de HGF (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. și te Heesen, S. Un sistem genetic bazat pe split-ubiquitin pentru analiza interacțiunilor dintre proteinele membranare in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. și Tavernier, J. proiectarea și aplicarea unei capcane de interacțiune pe bază de receptor de citokine (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, J. J. și Herskowitz, I. izolarea ORC6, o componentă a complexului de recunoaștere a originii drojdiei de către un sistem un hibrid (1993) știință 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. și Kuhl, D. Un sistem tri-hibrid pentru analiza și detectarea interacțiunilor ARN-proteine (1996) acizi nucleici Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. și Liu, J. O. un sistem cu trei hibrizi pentru detectarea interacțiunilor receptorilor ligand-proteine mici
(1996) PNAS 93 (23), 12817-12821