tidløs TCID50: en løsning på mange vira
denne måned dækker vi en gammel klassiker, Tissue Culture Infectious Dose 50 assay eller TCID50. Tcid50-analysen bruges til at kvantificere virale titere ved at bestemme den koncentration, hvor 50% af de inficerede celler udviser cytopatisk virkning (CPE). Så længe virussen af interesse forårsager celledød, har dette assay fordelen ved at være billigt og let at implementere, også når virusspecifikke antistoffer ikke er tilgængelige. Faktisk kræves der meget lidt information om selve virussen, hvilket gør det til et vigtigt redskab til at studere nye og nye patogener.
TCID50 assay: hvad det er, og hvordan man bruger det
i en TCID50 assay tilføjes serielle fortyndinger af en virus på monolag af celler og efterlades, indtil CPE kan ses. På dette tidspunkt kan effekten af den serielle fortynding på cellerne scores enten på en diskontinuerlig eller kontinuerlig måde. På en diskontinuerlig måde anvendes den enkelte fortynding, hvor 50% af cellerne viser CPE, til omtrent at kvantificere mængden af virus, der er til stede i den oprindelige bestand. Dette er ret ligetil og kræver ikke yderligere analyse. Det kommer dog også med en grad af unøjagtighed, da det ikke tillader nøjagtigt at skelne inden for samme fortynding.
mere nøjagtig information kan opnås kontinuerligt ved hjælp af en kolorimetrisk aflæsning, f. eks. et metabolisk substrat med specifik absorbans, hvor mængden af signal erhvervet er proportional med antallet af levende celler. Absorbansværdierne for de forskellige fortyndinger kan derefter plottes i en kontinuerlig ikke-lineær regressionsdosisresponskurve, hvorfra det vil være muligt at ekstrapolere mere nøjagtige TC50-værdier. Den diskontinuerlige metode er tilstrækkelig, hvis der ikke kræves en præcis titer, eller til at bestemme, hvilken koncentration af virus der er nødvendig for at opnå en vis procentdel af infektion i nedstrømsanalyser (en fordel ved TCID50 er, at den kan udføres på cellelinjen af interesse, så længe virussen forårsager CPE). Men selv i disse tilfælde kan det være bedre at bruge fortyndinger folder mellem 1:2 og 1:5 for at forbedre nøjagtigheden. Når det i stedet er nødvendigt med en mere nøjagtig kvantificering, for eksempel når man sammenligner effekten af forskellige behandlinger eller mutationer på virustitre, kan en kolorimetrisk metode foretrækkes.
fra fortyndinger til titere
TCID50-værdier giver en indikation af, hvor meget vira der er behov for for at have CPE i 50% af cellerne. Men hvordan man går fra dette til den faktiske mængde virus pr. ml? Formlen er ret simpel, og den består i at multiplicere tcid50-værdien med 0,7. Dette kommer fra Poisson-fordelingen anvendt på virusinfektion, der siger, at sandsynligheden for at nå 50% infektion i en fuldt tilladelig cellelinie opnås ved en mangfoldighed af infektion på cirka 0,7. Dette er ikke altid sandt, men det er en god tilnærmelse til de fleste applikationer.
problemerne med at tælle vira
så nøjagtige som man kan være, er det aldrig let at tælle vira. For det første er serielle fortyndinger-af deres egen natur – en fejlkilde. For det andet – og dette er især relevant for høje titre af virus-selv det mindste volumen, der forbliver fastgjort til enden af en pipettespids, kan bære nok virale partikler til at gøre en væsentlig forskel i kvantificeringen. For det tredje er den biologiske variation af systemet høj. Plate den samme mængde celler, tilføje den samme mængde virus, stoppe infektionen på samme tid, og procentdelen af infektion kan være tæt, men aldrig nøjagtig det samme.
endelig, når du vurderer en behandling, der (som du ville håbe!) reducerer virustitre, mængden af virus kan falde under analysedetekteringstærsklen.
kunsten at tælle vira
den gode nyhed er, at når du først kender dine problemer, er du ikke langt fra en løsning! Nøjagtighed i seriefortynding kan reduceres ved automatisering, men selv når dette ikke er tilgængeligt, kan nogle små tip gøre forskellen. Disse inkluderer udskiftning af pipettespidser og indsæt aldrig en pipettespids dybere end en millimeter i den næste fortynding for at undgå ved et uheld at overføre nogle ekstra logfiler med virus, der lige sidder fast på den ydre plast. Replikater er også vigtige, og jo mere for miniaturiserede analyser. 96 brøndplader tillader samtidig håndtering af flere prøver på en måde, som flere metoder med lav gennemstrømning (som plakassay) ikke tillader, men de kommer med yderligere variation, da små mængder er endnu mere følsomme over for de spørgsmål, der er diskuteret ovenfor. Mens tekniske replikater går en eller anden måde for at løse dette, prøver vi på VRS at køre eksperimenter, der kræver en kolorimetrisk TCID50 i biologisk tre eksemplarer. Dette øger robustheden af tilgangen og gør det muligt at udelukke falske punkter i datasættet uden at miste betydning. Nøjagtige TC50-værdier kræver en ikke-lineær regressionsdosisrespons af de kolorimetriske data, som programmer som GraphPad prisme let kan generere. Imidlertid vil ethvert programs evne til at plotte denne form for kurve strengt afhænge af kvaliteten af dataene og på de tætte numeriske værdier af replikaterne. En visuel inspektion af kurverne og de genererede TC50-værdier anbefales stærkt for at korrigere situationer, hvor ekstrapoleringen er skæv af falske datapunkter. Frem for alt tyder vores erfaring på, at eksperimenter, der kræver tcid50-aflæsning, ud over standardviruslagetitreringer muligvis har brug for yderligere trin til optimering, både for at bestemme de bedste biologiske forhold, der sikrer opstrøms indsamling af reproducerbare mængder virus (f. eks. cellelinie, pladeformat, infektionens mangfoldighed, tidspunkter) og det bedste koncentrationsinterval, der skal testes på tcid50-analysen (f.eks. startkoncentration og fortyndingsfoldning).
celledød eller flotte billeder?
det er ikke let at tælle døde celler, da de ofte forlader pladen ved den første vask – antages, at de stadig er der i første omgang! Dette hjælper ikke med nøjagtighed. Selvom det er dyrere og besværligt, når et godt antistof er tilgængeligt, er immunofluorescensfarvning den tilgang, som vi generelt ville vælge. Analysen kan stoppes før celledød, og følsomheden er generelt højere, hvilket tillader mere kontrol og højere nøjagtighed. Derudover kan denne metode bruges til vira, der ikke forårsager CPE, eller som tager lang tid at gøre det (og lad os se det i øjnene, nogle gode billeder af en virus i aktion er langt mere opløftende!). Celleskader er imidlertid varemærket for de fleste infektioner og for flere nye vira, som vi ved meget lidt om. Flere kolorimetriske / fluorescerende journalister er nu tilgængelige for følsomt at måle og skelne mellem forskellige typer cytotoksicitet. Det ser ud til, at denne gamle klassiker er klar til nye udfordringer!