Die Kristallstruktur einer Tetrahydrofolat-gebundenen Dihydrofolat-Reduktase zeigt den Ursprung der langsamen Produktfreisetzung

Isolierung durch Kristallisation des endogenen (6s) -5,6,7,8-Tetrahydrofolat-gebundenen E. coli DHFR-Komplexes

Die Struktur des eDHFR: Der binäre FH4-Komplex wurde durch molekularen Ersatz unter Verwendung des geschlossenen ternären Komplexes eDHFR: Folat: NADP+ (PDB ID: 7DFR) 50 bestimmt. Wie in Fig. 2 bestätigt die klare Elektronendichte den co-gereinigten endogenen Liganden als FH4 basierend auf der tetraedrischen Geometrie von sp3 C6, die mit einem 6s-Stereoisomer übereinstimmt. Dies steht im Gegensatz zur trigonalen planaren Geometrie von sp2 C6 in einem FH2-Binärkomplex, der unter ähnlichen Kristallisationsbedingungen erhalten wurde.

Vergleich der Ligandenstrukturen von eDHFR:FH4 (grün, obere Abbildung) und eDHFR:FH2 (orange, untere Abbildung) Komplexen. Die Fo-Fc-Omit-Elektronendichtekarten, die um die Liganden herum konturiert sind, sind auf 3,0 σ-Ebene dargestellt. Die Ansichten rechts werden aus den links gezeigten Perspektiven um 90° gegen den Uhrzeigersinn um die vertikale Achse gedreht. FH4 und FH2 sind als Sticks dargestellt. Das C6-Kohlenstoffatom ist magenta gefärbt, und seine verschiedenen Hybridisierungszustände in FH4 und FH2 sind durch magentafarbene Pfeile gekennzeichnet. Alle anderen Atome sind wie folgt gefärbt: Sauerstoff in Rot, Stickstoff in Blau, Kohlenstoff in Grün und Orange für FH4 bzw. Zur Vereinfachung der Anzeige werden nur Nicht-Wasserstoffatome angezeigt

Um zu verstehen, warum wir den FH4-Komplex erhalten, während andere gescheitert sind, haben wir festgestellt, dass der Ursprung der beiden verschiedenen Ligandenkomplexe (FH4 vs. FH2) der Zeitpunkt der Kristallernte und damit die Dauer des Kristallwachstums ist. Eine in Fig. 3, die den Änderungen der Elektronendichten des gebundenen Liganden an verschiedenen Tagen des Kristallwachstums folgt, zeigte, dass der FH4-zu-FH2-Zerfall (reflektiert im sp3-zu-sp2-Übergang an C6-Position) ungefähr 2-3 Tage nach dem Kristallisationsaufbau auftrat.

Stereoansichten des Zeitverlaufs von Fo-Fc lassen Änderungen der Elektronendichtekarte aus, die der Umwandlung von FH4 in FH2 entsprechen. Die Fo-Fc-Omit-Elektronendichtekarten, die um die Liganden herum konturiert sind, sind auf 3,0 σ-Ebene dargestellt. Der eDHFR:FH4 binäre Komplexkristalle wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur gezüchtet. Zu jedem Zeitpunkt wurde ein einzelner Kristall aus einem unabhängigen Kristalltropfen durch Flash-Freezing für Röntgenbeugung geerntet. Die Ligandenstrukturen von FH4 und FH2 von vollständig verfeinerten binären komplexen Strukturen nach 2 bzw. 14 Tagen sind in jeder Figur als Referenzen dargestellt, um sie mit der Änderung der Elektronendichten zu vergleichen. Die Omit-Karten für die nach 3 und 6 Tagen geernteten Kristalle wurden nach anfänglicher struktureller Verfeinerung ohne Einführung von Liganden oder Lösungsmitteln erzeugt. Die Überlagerung der Proteinstrukturen erfolgte mit PyMOL69

Dies ist unseres Wissens das erste Mal, dass ein authentischer FH4-gebundener DHFR-Komplex mit einer einzigen Domäne isoliert wurde. Wir haben das Protokoll zur Reproduktion der Kristallisation des eDHFR: FH4-Komplexes validiert und den zeitlichen Verlauf des FH4-zu-FH2-Zerfalls durch mindestens zwei unabhängige Replikate zu jedem Zeitpunkt der Kristallernte bestätigt (Ergänzende Abb. 1). Die mittleren Elektronendichten entlang des zeitlichen Verlaufs des Zerfalls des Liganden zeigen deutlich den Übergang von sp3 zu sp2 an der C6-Position und die damit einhergehende Rotation des Benzoylrings des gebundenen Liganden (Abb. 3). Dies kann der Ligandenkonformation im Übergangszustand in katalytischer Vorwärtsrichtung ähneln. Der beobachtete Zerfall von FH4 zu FH2 während des Kristallwachstums spiegelt wahrscheinlich nicht die Rückkatalyse durch DHFR wider, die die Umwandlung von FH4 in FH2 beinhaltet. Es wird wahrscheinlich auch nicht durch Licht induziert, wenn man bedenkt, dass die Kristallisationstropfen während des Kristallwachstums bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wurden und der zeitliche Verlauf des Zerfalls von FH4 zu FH2 in der Größenordnung von Tagen liegt. Wir haben auch die Co-Kristallisation mit den Reduktionsmitteln Dithiothreitol (DTT) oder Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) bei 2-3 mm Konzentration sowie die Einführung von DTT oder TCEP für bis zu 20 min Kristall Einweichen vor der Ernte bei 2 Tagen, 3 Tagen, 14 Tagen bis zu 7,5 Monaten getestet. Auch diese Verfahren hatten keinen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit von Änderungen der Liganden-Elektronendichte qualitativ entlang des Abklingzeitverlaufs des eDHFR: FH4-Komplexes in der in dieser Studie identifizierten kristallinen Form (Ergänzende Abb. 1). Daher ist es wahrscheinlich, dass das aktuelle Kristallisationsprotokoll den endogenen FH4-Komplex, der in den eDHFR-Proteinproben co-gereinigt wurde, bevorzugt kristallisiert, und sein Zerfall im Kristall ist unter den von uns getesteten Bedingungen irreversibel, wahrscheinlich aufgrund von Oxidation bei einem endlichen Sauerstoffgehalt. Obwohl die schnelle vorwärtskatalytische Reaktion der Herstellung von FH4 aus FH2 in Gegenwart einer überschüssigen Menge an NADPH wie in vivo thermodynamisch begünstigt ist, kann der langsame Zerfall des FH4-Komplexes zurück zu einem FH2-Komplex ohne eine fortgesetzte Zufuhr von NADPH auftreten, wie wir hier unter der In-vitro-Kristallisationsbedingung beobachtet haben. Somit, Das Geheimnis, warum der lange verfolgte FH4-Komplex schwer zu erhalten war, zeigt sich in seiner intrinsischen Instabilität. Es ist sehr wahrscheinlich, dass der Schlüssel zu unserem Erfolg, die chemisch labile FH4-Komplexstruktur zu erhalten, die rechtzeitige Ernte von gut beugenden Kristallen innerhalb von 2 Tagen Wachstum unter den hier identifizierten Kristallisationsbedingungen ist. Darüber hinaus zeigt eine Untersuchung des DHFR-Feldes, dass viele kristallographische19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 und NMR12,13,15,17,19,25,26 studien von DHFR verwendeten Dialyse, um endogene Liganden zu entfernen, bevor die exogenen Liganden von Interesse eingeführt wurden. Wir identifizierten eine Kristallisationsbedingung, die den endogenen FH4-gebundenen DHFR-Komplex ohne Dialyse der Proteinprobe oder Einführung zusätzlicher Substrate oder Produkte isoliert. Wir postulieren, dass die aktuelle Kristallisationsbedingung für den eDHFR: FH4-Komplex die FH4-gebundene Form gegenüber anderen Formen wie dem eDHFR: FH2: NADP (H) -Ternärkomplex bevorzugt.

Strukturelle Charakterisierung des eDHFR:FH4-Komplex

Der FH4-Komplex nimmt in eDHFR eine okkludierte Konformation an (siehe Abb. 4 und 5). Dies steht im Einklang mit den bisherigen Erkenntnissen, die darauf hindeuten, dass alle binären und ternären FH4-Komplexe des Grundzustands des katalytischen Zyklus (Posthydridtransfer und sp2-zu-sp3-Umwandlung bei C6) in okkludierten Konformationen auftreten. Dies ist auf den sterischen Zusammenstoß des gekippten Pterinrings von FH4 mit dem Nicotinamidring von NADP (H) zurückzuführen, der in der geschlossenen Konformation der Met20-Schleife auftreten würde (Abb. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Wie in Fig. 4 hat FH4 Van-der-Waals-Kontakte und günstige polare Wechselwirkungen mit aktiven Standortresten und Gewässern. Insbesondere verankern zwei zweizähnige Salzbrücken mit Asp27 und Arg57 die beiden Enden von FH4, Aminopyrimidin (N3 und Exocyclic-NH2) bzw. α-Carboxylat in nahezu identischen Positionen wie in Substrat / Analog-Komplexen12,20,24,45.

Die aktive Standortstruktur des eDHFR: FH4-Komplexes in Stereoansichten. eine Seitenkette (Cyan) innerhalb von 4 Å von FH4 (grün) und die Met20-Schleife (gelb) sind als Sticks dargestellt. Sekundärstrukturen werden als Cartoons in Grau und Gewässer innerhalb von 3,5 Å von FH4 als Kugeln dargestellt. Polare Wechselwirkungen mit FH4 sind gestrichelt angedeutet. Die Fo-Fc-Elektronendichtekarte, die FH4 auslässt, ist auf einem 3,5 σ–Niveau in Rot und die 2Fo-Fc-Omit-Karte auf einem 1,0 σ-Niveau in Blau für Rückstände und Gewässer dargestellt. Die drei Konformere der Ile14-Gly15-Amidbindungen sind durch einen gestrichelten Kreis und rote Pfeile gekennzeichnet. b Eine erweiterte Ansicht der Ile14-Gly15-Verknüpfung

Überlagerung des FH4-Komplexes mit FH2- und FH4-Analogkomplexen. Die aktuellen FH4-, FH2- und gemeldeten eDHFR-Komplexe und der gemeldete 5-Formyl-FH4-Komplex zusammen mit ihren okkludierten Met20-Schleifenkonformationen, Phe31-Resten und den entsprechenden Liganden sind grün, magenta und gelb gefärbt. Alle anderen Strukturen aus PDB-IDs: 1DYJ (ddFH4) 45, 5CCC (ddFH4: NADP +) 12, 1RF7 (FH2) 24, 4PDJ (FH2: NADPH) 20 und 4PSY (Folat: NADP +) 20 sind grau gefärbt. Der rot gestrichelte Kreis zeigt die π-π-Wechselwirkungen zwischen Phe31 und den Ligandenbenzoylgruppen an, die in Abhängigkeit von den gebundenen Liganden zwei unterschiedliche Orientierungen annehmen. FH4 und 5-Formyl-FH4 gehören im Gegensatz zu ddFH4, FH2 und Folat zu einem Cluster, während die Phe31-Seitenketten in allen ausgerichteten Strukturen nahezu in derselben Position bleiben. Die Met20-Schleifen werden in drei allgemeine Konformationszustände eingeteilt: geschlossen, teilweise geschlossen und verschlossen. Nur die geschlossenen Konformationen können die Nikotinamidgruppe des NADP (H) -Cofaktors, der in das aktive Zentrum eintritt, strukturell aufnehmen

Es gibt zwei Wassermoleküle, die die Met20-Schleife und FH4 über ein Wasserstoffbindungsnetzwerk überbrücken, an dem Gly15 (C = O) -wat1-FH4 (N5) und Glu17 (NH) -wat2-FH4 (N10) beteiligt sind (Abb. 4). Diese Wechselwirkungen fehlen in den zuvor berichteten (6R) -5,10-Dideazatetrahydrofolat (ddFH4) -Komplexen12,45 aufgrund des N-C-Ersatzes an den Positionen 5 und 10 im Analogon. Dies könnte den beobachteten Unterschied in der Met20-Konformation im Analogon im Vergleich zum FH4-Komplex verursachen (Abb. 5). Die einzigen verfügbaren Strukturen in der PDB, die der Met20-Schleifenkonformation im FH4-Komplex sehr ähnlich sind, sind ein 5-Formyl-FH4-Komplex (Abb. 5, PDB ID: 1JOM)51 und zwei eDHFR-Nanobody allosterische Hemmkomplexe, die auf verschiedene DHFR-Epitope mit nanomolarer Affinität abzielen (Ergänzende Abb. 2, PDB IDs: 3K74 und 4EIG) 28,29. Der 5-Formyl-FH4-Komplex bewahrt das Brückenwasser zwischen Glu17 (NH) und FH4 (N10) wie im FH4-Komplex, trotz ihrer unterschiedlichen Raumgruppen P61 bzw. P212121. 5-Formyl-FH4, auch bekannt als Folinsäure oder Leucovorin, ist ein von der FDA zugelassenes „Rettungs“ -Medikament zur Verhinderung schädlicher Wirkungen von Methotrexat während der Chemotherapie53. Die γ-Carbonsäuregruppe von FH4 zeigt eine geringe Elektronendichte (Fig. 4), was auf eine Störung oder mehr Freiheit der Bindungsrotation um die Cß-Cy- oder Cy-Cδ-C-Achse hindeutet als in anderen Teilen der Liganden.

Zusätzlich zum Wassernetzwerk fanden wir den strukturellen Ursprung der stabilisierenden Wechselwirkungen im FH4-Komplex und in der langsamen Produktfreisetzung basierend auf dem strukturellen Vergleich aktueller FH4- und FH2-Binärkomplexe und zuvor gemeldeter eDHFR-Strukturen. Erstens führt der Van-der-Waals-Kontakt mit der Glu17-Seitenkette zu einer zusätzlichen Abschirmung von FH4 vor Lösungsmittel (Abb. 4), die in Substrat- oder produktanalogen (6R) -5,10-Dideazatetrahydrofolatkomplexen12,20,24,45 fehlt. Zweitens deutet die klare Elektronendichte von drei alternativen Rückgratkonformationen der konservierten Ile14-Gly15-Amidbindung auf einen entropischen Beitrag zur Stabilität des FH4-Komplexes aus der lokalen Flexibilität am Met20-Schleifenanker hin (Abb. 4). Bemerkenswerterweise zeigten frühere Mutagenese-Studien, dass Ile14 entscheidend für die Kontrolle der Flexibilität der Met20-Schleife ist, während I14V-, I14A- und I14G-Varianten alle eine langsamere Hydrid-Transferrate, eine höhere Flexibilität der Met20-Schleife, wie sie in einer offenen Konformation in Kristallstrukturen beobachtet wurde, eine erhöhte Temperaturabhängigkeit des primären kinetischen Isotopeneffekts und eine höhere Aktivierungsenergie des Übergangszustands zeigten, berechnet aus hybriden QM / MM-Simulationen23,40. Drittens führt die Rotation des Benzoylrings zu elektrostatisch günstigen Rand-zu-Gesicht-π-π-Wechselwirkungen mit dem konservierten Phe31 im FH4-Komplex im Gegensatz zu protonennahen (Rand-zu-Rand) abstoßenden Wechselwirkungen in FH2-, Folat- und ddFH4-Komplexen unabhängig von der NADP (H) -Bindung (Abb. 5, vergrößerte Ansicht, Fig. 6)54,55. Die funktionelle Implikation dieser Strukturänderung wird auch durch die Beobachtung der gleichzeitigen Rotation des Benzoylrings und des Übergangs von sp3 zu sp2 an der C6-Position des gebundenen Liganden während des zeitlichen Verlaufs des Zerfalls von FH4 zu FH2 im Komplex unterstützt (Abb. 3). Die Rolle von Phe31 bei der Kontrolle der Produktfreisetzung wird durch frühere Mutagenesestudien weiter bestätigt56, die zeigten, dass F31V- und F31Y-Varianten von eDHFR zusätzlich zum Effekt der Mutationen auf die Verlangsamung des Hydridtransfers einen zweifachen Anstieg der Steady-State-Ratenkonstante kcat und einen geschätzten 20- bis 50-fachen Anstieg der Produktfreisetzungsrate aufwiesen.

Elektrostatische Wechselwirkungen von π-π-Systemen. Siehe refs 54,55 für Details

In Anbetracht der dynamischen Eigenschaften des jeweiligen E. coli DHFR-Systems kann der hier beobachtete stabile okkludierte eDHFR: FH4-Komplex (ein Zwischenprodukt mit niedriger freier Energie in seiner dynamischen Landschaft) der Kinetik der langsamen Produktfreisetzung (Koff-Rate der FH4-Dissoziation, der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt des eDHFR-Katalysezyklus) vernünftigerweise zugrunde liegen. Nach früheren NMR-Relaxationsdispersionsstudien folgt jeder Schritt des katalytischen Zyklus von E. coli DHFR eher einer „Konformationsauswahl“ als einem „induzierten Fit“ -Mechanismus15. Folglich hängt die Abtastrate jedes Schritts entlang der Reaktionskoordinate von der Konformationsabtastrate des Enzyms ab15 (z. B. der Übergangszustand, der für einen schnellen Hydridtransfer oder eine geschwindigkeitsbegrenzende Produktfreisetzung zuständig ist). Dies bedeutet, dass je stabiler der Grundzustand ist und je unterschiedlicher er vom angeregten Unterzustand ist, desto größer sind die freien Energiekosten, die zum Abtasten solcher Konformationen erforderlich sind. Für eDHFR wird dies notwendigerweise die Reorganisation des aktiven Standorts und der flexiblen Met20-Schleife beinhalten. In NMR-Relaxationsdispersionsstudien von eDHFR15 wurde vorgeschlagen, dass der subpopulierte angeregte Zustand für den chemischen Schritt des Hydridtransfers eine okkludierte Konformation annimmt (dessen Grundzustand Michaelis-Komplex ist in einer geschlossenen Konformation). Der subpopulierte angeregte Zustand für den Produktfreisetzungsschritt nimmt jedoch eine geschlossene Konformation an (deren Grundzustand FH4-Komplex in einer okkludierten Konformation ist). Entlang der Reaktionskoordinate befindet sich der aktuell beobachtete eDHFR:FH4-Binärkomplex zwischen den Zwischenkomplexen eDHFR:FH4:NADP+ und eDHFR:FH4:NADPH (Abb. 1). Beide nehmen okkludierte Konformationen an, wobei die Nikotinamideinheit des Cofaktors von der aktiven Stelle wegweist15. Um den „closed excited substate“ während des ratenbegrenzenden Produktfreisetzungsschrittes 15 abzutasten, muss eine aktive Standortreorganisation aus dem okkludierten Grundzustand erfolgen. Dies wird durch das stabile katalytische Zwischenprodukt eDHFR: FH4 dargestellt, das in dieser Studie eingefangen wurde. Die Produktdissoziationsrate koff von FH4 wurde bei Cofaktorbindung mit einem zweifachen Anstieg für eDHFR erhöht: FH4: NADP + im Vergleich zu eDHFR: FH4 und einem achtfachen Anstieg für eDHFR: FH4: NADPH im Vergleich zu eDHFR:FH4 gemessen bei pH 6 und pH 9 durch Wettbewerbsexperimente35. Dies deutet auf eine beschleunigte Produktfreisetzung und erhöhte Konformationsabtastraten hin, wenn ein Cofaktor gebunden ist. Obwohl eine authentische eDHFR: FH4: NADPH-ternäre komplexe Grundzustandsstruktur noch nie zuvor berichtet wurde, nehmen wir an, dass es eine nennenswerte Ähnlichkeit mit dem eDHFR: FH4-Binärkomplex geben kann, da alle FH4-gebundenen Grundzwischenzustände eine okkludierte Konformation annehmen 15. Wir erwarten jedoch, dass die Kofaktorbindung die Population der angeregten Teilzustände erhöhen wird, die zuvor auf der Grundlage von NMR-Relaxationsdispersionsstudien vorgeschlagen wurden, um in einer geschlossenen Konformation zu sein15. In Übereinstimmung damit beobachteten wir, dass in einem ternären Komplex der eDHFR: FH2: NADP (H) -Struktur (auch in unserer Studie unter separaten Kristallisationsbedingungen bestimmt) die Met20-Schleife gestört wurde. Dies deutet auf einen allgemeinen Mechanismus des Cofaktor-erleichterten Ligandenaustauschs hin, indem die Konformationsabtastrate erhöht wird, wenn der Cofaktor mit seiner Nikotinamideinheit gebunden ist, die vom aktiven Zentrum weg zeigt.

Im FH4–Komplex beträgt der Abstand zwischen dem FH4-Benzoylring (C1ʹ) und dem Phe31 (Cz) 4,93 Å, was um (~ 0,3-0,6 Å) signifikant kürzer ist als die entsprechenden Abstände in aktuellen FH2- und zuvor gemeldeten FH2-Komplexen (PDB ID: 1RF7, 4PDJ) 20,24, die 5,22, 5,55 bzw. 5,32 Å betragen. Ein ähnlicher Trend der Abstandsverkürzung entlang der Reaktionskoordinate von eDHFR wurde in zwei unabhängigen Computerstudien hervorgehoben. Eine QM / MM-Studie berechnete, dass der entsprechende Abstand vom Michaelis-Komplex zum Übergangszustand um ~ 0,3 Å verkürzt wird, wenn die Hydrid-Transferreaktion stattfindet, und dass es in diesem Abstand (~ 0,01 Å) nur einen geringen Unterschied zwischen dem Übergangszustand und dem Reaktionsprodukt gibt27. Eine andere Studie mit gemischter quanten- / klassischer Molekulardynamik schlug eine dramatischere Verkürzung des entsprechenden Abstands um ~ 1 Å vor, wenn sich die Reaktion vom Reaktanten zum Übergangszustand entwickelt18. Daher stimmen unsere kristallographischen Beobachtungen im Allgemeinen mit früheren Computermodellen überein, was darauf hindeutet, dass der FH4-Komplex bis zu einem gewissen Grad die physikalische Natur des Übergangszustands beibehält. Dies steht auch im Einklang mit früheren Beobachtungen zur dynamischen Energielandschaft von eDHFR, die durch NMR-Relaxationsdispersion abgebildet wurden, dass jedes Zwischenprodukt im katalytischen Zyklus tief liegende angeregte Zustände abtastet, deren Konformationen den Grundzustandsstrukturen der vorhergehenden oder folgenden Zwischenprodukte ähneln15. Da Enzyme den Übergangszustand stabilisieren, könnte eine langsame Produktfreisetzung der DHFR-Familie auf die Verschleppung der physikalischen Natur des Übergangszustands auf den Reaktionsproduktkomplex zurückzuführen sein. Dies wird aus dem hier ermittelten Langstreckenkomplex FH4 vorgeschlagen, zusätzlich zu spezies-spezifischen Konformationsänderungen, die während des katalytischen Zyklus erforderlich sind32.

Charakterisierung eines okkludierten Komplexes von eDHFR mit einem nanomolaren Bindungsaffinitäts-Slow-Onset-Inhibitor

Die Röntgenkristallographie zeigt, dass der Komplex von eDHFR mit einem Slow-Onset-Tight-Inhibitor AMPQD46 ebenfalls die okkludierte Konformation aufweist. Die Met20-Schleife nahm im AMPQD-Komplex eine Konformation an, die der des ternären Komplexes mit einem antidiabetischen Biguanidphenformin und NADP + (PDB ID) ähnelt: 5UIH)52. Auf der anderen Seite konnte das von der FDA zugelassene Chemotherapeutikum Methotrexat zuvor durch Röntgenkristallographie24,47, NMR48 und Einzelmolekülkinetik49 in der geschlossenen DHFR-Konformation binden (Abb. 7). Diese Diskrepanz in den Proteinkonformationen war unerwartet, da alle drei Inhibitoren ein gemeinsames strukturelles Merkmal aufweisen: die Biguanidgruppe von Phenformin, die Diaminopyrimidingruppe von AMPQD und die Diaminopteringruppe von Methotrexat, die jeweils mit einer Phenylgruppe verbunden sind ein flexibler Linker. Eine genaue Betrachtung aus der strukturellen Überlagerung der entsprechenden eDHFR-Inhibitorkomplexe (Fig. 7) zeigte, dass die Methylamino-Verknüpfungsgruppe des Methotrexats (fehlt in Phenformin und AMPQD) eine Position einnahm, die zu einem möglichen sterischen Zusammenstoß mit der Met20-Schleife führen würde, wenn sie eine okkludierte Konformation wie in den Phenformin- und AMPQD-Komplexen annahm. Wir haben zuvor gezeigt, dass AMPQD eine relativ höhere Präferenz (eine dreifache Abnahme von IC-50 und Ki) für die Hemmung von eDHFR gegenüber humanem DHFR46 zeigte. Eine noch höhere Speziesspezifität für E. ein Anstieg gegenüber humanem DHFR (~ 30-fach) wird für die Stammverbindung von AMPQD beobachtet, der die Aminophenylschwanzgruppe und der Methylenlinker fehlen46. Die aktuelle Kristallstruktur des okkludierten Komplexes von eDHFR mit AMPQD liefert eine plausible mechanistische Erklärung für seine Speziesspezifität, die auf Unterschiede in den Konformationsgleichgewichten von humanem DHFR und eDHFR zurückzuführen ist. Ersteres wird ausschließlich in geschlossenen Konformationen beobachtet, während letzteres eine höhere Konformationsflexibilität zeigt als sowohl in geschlossenen als auch in okkludierten Konformationen, wie im Folgenden erläutert.

Struktur des eDHFR: AMPQD-Hemmkomplexes. eine Stereoansicht der aktiven Site-Interaktionen mit AMPQD mit der Fo-Fc-Omit-Map auf einem 3,5 σ-Niveau. Proteinseitenketten (Cyan) innerhalb von 4 Å von AMPQD (grün) sind als Sticks dargestellt, darunter zwei Reste aus der Met20-Schleife (gelb). Polare Wechselwirkungen sind gestrichelt angedeutet. b Überlagerung von AMPQD (grün), Phenformin (gelb, PDB: 5UIH) 52 und Methotrexatkomplexen (grau dargestellt als dünne Stäbchen aus PDB: 1RA3, 1DDS) 20,47. Met20-Schleifen werden als Cartoons und Liganden als Sticks dargestellt. Die chemischen Strukturen der Liganden sind oben gezeichnet. NADP (H) wird zur Vereinfachung der Anzeige in keiner der Strukturen angezeigt

Vergleich von DHFR-Konformationen basierend auf Clustering

Ein Clustering von DHFR-PDB-Strukturen unter Verwendung der RMSD der Met20-Loop-Backbone-Ca-Atome als Entfernungsmetrik (Abb. 8 und ergänzend Fig. 3) zeigt an, dass menschliches DHFR ausschließlich eine geschlossene Konformation annimmt (katalytisch kompetent für NADPH-Bindung), während eDHFR sowohl mit geschlossenen als auch mit okkludierten Konformationen viel flexibler ist. Die okkludierten Konformationen sind seltener (17%) in eDHFR-Strukturen zu sehen. Sowohl der ratenbegrenzende Produktfreisetzungskomplex mit FH4 als auch der langsam einsetzende inhibitorische Komplex mit AMPQD nehmen eine okkludierte Konformation von eDHFR an (Abb. 9), die im HVE nur selten dargestellt ist (Ergänzende Abb. 3). Interessanterweise teilen sowohl FH4 als auch AMPQD die Eigenschaften der nanomolaren Affinität und der langsamen Freisetzung von eDHFR35, 36,46, wobei die Position der Schlüsselstickstoffatome auf den Heterocyclen stark konserviert ist und Unterschiede in den Schwänzen offensichtlich sind. Dies deutet auf eine neue Strategie zur Entwicklung von DHFR-Inhibitoren hin, indem auf okkludierte eDHFR-Konformationen abgezielt wird. Wir schlagen auch eine Strategie zur Bekämpfung von Arzneimittelresistenzen vor. Wie in der ergänzenden Fig. 4 beim Vergleich der Konformation von AMPQD mit FH4 und Trimethoprim mit FH4 gibt es subtile Unterschiede in den van-der-Waals-Hüllen. Die Trimethoprim-eDHFR-Escape-Varianten von E. coli DHFR besitzen Mutationen, die auch die inhibitorische Funktion von AMPQD57 blockieren. Durch die Untersuchung der Unterschiede in den Wechselwirkungen kann man nach anderen Liganden suchen, die diese Wechselwirkungsunterschiede mit FH2 und FH4 minimieren. Dies könnte sicherstellen, dass Mutationen, die die Inhibitorbindung verringern, auch die Bindungsaffinität von FH2 und FH4 verringern.

Clustering von 162 DHFR-Strukturen basierend auf ihrer paarweisen Ca RMSD der Met20-Schleifen. DHFR-Strukturen werden durch Kreise dargestellt, die blau (beim Menschen), grün (eDHFR) und rot (in dieser Studie) ausgefüllt sind. Die Kantenlänge (lila gefärbt für die okkludierten bzw. goldfarben für die geschlossenen Konformationen) ist proportional zur maximalen RMSD der Met20-Schleifenkonformatoren. Ein detaillierteres Clusterdiagramm finden Sie in den ergänzenden Informationen

Überlagerung von AMPQD (grün) und FH4-Komplexen (gelb). Die Met20-Schleifen sind als Cartoons und Liganden als Sticks dargestellt. Die Ansicht rechts wird aus der links gezeigten Perspektive um 90° im Uhrzeigersinn um die vertikale Achse gedreht

Charakterisierung eines ternären Komplexes von eDHFR

Schließlich in einem eDHFR:FH2:NADP(H) ternärer Komplex mit sowohl co-gereinigtem endogenem Liganden als auch Cofaktoren (Abb. 10) haben wir festgestellt, dass die Met20-Schleife gestört wird. Dies unterstützt die Rolle der Cofaktorbindung bei der Verbesserung der Konformationsstichprobe für einen schnellen Ligandenaustausch oder der Erleichterung der Produktfreisetzung über einen allosterischen Mechanismus (TS‡ 2, Abb. 1)12,13,14,15. Die Nicotinamid-Ribose-Einheit schwingt vom aktiven Zentrum weg (Abb. 10) ähnlich dem okkludierten FH4 ternären Komplex12. Sein Redoxzustand ist aufgrund der Elektronendichte unbekannt. Die Fähigkeit, verschiedene endogene ligandengebundene, binäre und ternäre eDHFR-Komplexe unter unterschiedlichen Kristallisationsbedingungen zu isolieren, legt nahe, dass eDHFR eine Mischung von Molekülspezies mit unterschiedlichen gebundenen Liganden und einem Ensemble von Konformationen enthält. Die Wirksamkeit des hier angewandten kristallographischen Ansatzes nutzt die molekulare Inhomogenität aus, indem der Dialyseschritt weggelassen wird, um eine lang anhaltende und chemisch labile FH4-komplexe Kristallstruktur zu isolieren. Dies steht im Gegensatz zu dem typischen Verfahren, bei dem DHFR-Proben durch Dialyse vorbehandelt werden, wodurch endogene Spurenliganden entfernt und die Probenhomogenität erhöht wird. Eine verbesserte Homogenität verbessert im Allgemeinen die Gesamterfolgsrate von Co-Kristallisations- oder Kristalleinweichexperimenten, wenn die interessierenden Liganden exogen eingeführt werden.

Stereoansichten des DHFR: FH2: NADP (H) ternären Komplexes. Die ungeordnete Met20-Schleife (Reste zwischen Ile14 und Pro21) ist als schwarze gestrichelte Linien angedeutet. Die Fo-Fc-Auslasskarte auf einer Ebene von 3,0 σ wird als rotes Netz angezeigt. Sekundärstrukturen sind als Proteine und Liganden in einer Stickdarstellung dargestellt. Atome sind wie folgt gefärbt: Kohlenstoff (weiß), Stickstoff (blau), Sauerstoff (rot) und Phosphor (orange)