Las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) han mostrado una actividad notable en neoplasias hematológicas malignas. Las moléculas de CAR se crean fusionando el fragmento variable de cadena única (scFv) derivado de un anticuerpo dirigido a un antígeno de superficie con el dominio de señalización de células T. Estas moléculas se injertan en las células T a través de un proceso de ingeniería que utiliza más comúnmente retrovirus o lentivirus, o, en algunos casos, plásmidos. CD19 es un blanco racional para las neoplasias malignas de células B, incluidos los linfomas, ya que se expresa en las células B durante todas las etapas de diferenciación, así como en las células que se han transformado de forma maligna . Las células CAR-T dirigidas contra CD19 han mostrado respuestas excelentes en pacientes con linfomas de células B recidivantes o refractarios, en particular linfoma difuso de células B grandes (LBBD) con algunas remisiones duraderas observadas, lo que ha ganado la aprobación de la FDA para esta indicación. Sin embargo, se necesitan dianas alternativas para otros tipos de linfoma que carecen de expresión de CD19, incluidas enfermedades como el linfoma de Hodgkin clásico (LH), el linfoma anaplásico de células grandes (LCA) y otros linfomas de células T.
Aunque la mayoría de los pacientes con LH se curan con terapias de primera línea, aproximadamente el 15% de los pacientes tienen enfermedad refractaria primaria o recaída posterior después de una respuesta inicial al tratamiento . El estándar de atención para los pacientes que recaen después del tratamiento de primera línea es la quimioterapia de dosis altas seguida de trasplante autógeno de células madre (TCMC), con cerca de la mitad de los pacientes que recaen después del trasplante . Desafortunadamente, el pronóstico para estos pacientes es precario, y el trasplante alogénico de células madre (ALOSCT) tradicionalmente ofrece la mejor posibilidad de remisión sostenida . Sin embargo, este tratamiento también está asociado con morbilidad y mortalidad significativas. Se necesitan terapias nuevas para los pacientes con LH recidivante y resistente al tratamiento.
ALCL es un subtipo de linfoma de células T periféricas con características heterogéneas . Si bien el pronóstico de los LCA positivos para la quinasa del linfoma anaplásico (ALK+) es bueno, con tasas de supervivencia a 5 años que por lo general oscilan entre 70 y 90%, los LCA negativos para ALK tienen un pronóstico más precavido, con tasas de supervivencia a 5 años de 40 a 60% . La terapia de rescate para pacientes con enfermedad quimiosensible generalmente consiste en dosis altas de quimioterapia seguida de TCMC. Sin embargo, el pronóstico para los pacientes con LCA recidivante o refractario que no son aptos para trasplante o fracasan en el tratamiento de segunda línea es sombrío, con un estudio retrospectivo que mostró una mediana de supervivencia sin progresión y supervivencia general de 3 y 1,8 meses, respectivamente . Por lo tanto, se necesitan abordajes de tratamiento alternativos para el tratamiento de pacientes con LCA recidivante o resistente al tratamiento.
Una característica definitoria tanto para el LH como para el LCA es la presencia de una molécula de superficie común, CD30, un receptor transmembrana y miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). CD30 también se expresa en otros linfomas, incluso universalmente en papulosis linfomatoide y en algunos casos de DLBCL, linfoma mediastínico primario de células B, micosis fungoide, linfoma de células T periféricas y leucemia/linfoma de células T en adultos . También se necesitan tratamientos nuevos para estos linfomas, especialmente para los pacientes que no responden al tratamiento inicial.
CD30 es un candidato excelente para terapias inmunitarias debido a su expresión restringida en las células tumorales, con expresión limitada en pequeños subconjuntos de linfocitos normales activados (no malignos), lo que lleva a un riesgo bajo de toxicidad fuera del tumor en el blanco.
El CD30 se ha explorado ampliamente como terapia basada en anticuerpos, desde desnudo hasta inmunocomponiado. Los resultados más notables se han logrado con brentuximab vedotina (BV), un conjugado de anticuerpos dirigido contra CD30, que de hecho ha mostrado buena tolerancia y actividad prometedora en linfomas CD30+, con una tasa de respuesta global (TRO) del 75% y una tasa de respuesta completa (RC) del 34% en pacientes con LH recidivante o refractario, y una TRO del 86% y una tasa de RC del 57% en LCA sistémicos recidivantes o refractarios . Aunque la VB parece tener respuestas excelentes, por lo general no son duraderas, ya que solo el 22% de los pacientes con LH recidivante o refractario no han progresado después de 5 años . Para superar algunos de los desafíos con la terapia basada en anticuerpos, a saber , persistencia limitada y penetración tumoral, se han explorado las células CAR-T. El éxito y la tolerabilidad de la VB proporcionaron pruebas de la viabilidad de apuntar a CD30 con células CAR-T.
Estudios preclínicos de células CAR-T dirigidas a CD30
Los primeros estudios de células CAR-T dirigidas a CD30 se realizaron a finales de la década de 1990 por Hombach et al. y mostró citólisis efectiva de líneas celulares CD30+ HL in vitro . Sin embargo, estas moléculas CAR carecían de señalización coestimulatoria, lo que limitaba su eficacia. Savoldo et al. propuso expresar esta molécula CAR en células T citotóxicas específicas del virus (Virus de Epstein-Barr) (VEB-CTL) para garantizar que estas células quiméricas recibieran señales de coestimulación adecuadas a lo largo del tiempo. Como era de esperar, estas células mantuvieron su capacidad de reconocer y destruir tumores del VEB+ y, al mismo tiempo, se dirigieron a las células cancerosas CD30+ (como las líneas de células tumorales HL y ALCL) tanto in vitro como in vivo en un modelo xenogénico de ratón . Los avances posteriores en el proceso de ingeniería han introducido endodominios coestimulantes dentro de la molécula CAR, lo que hizo que la fabricación fuera menos engorrosa y la necesidad de células T con especificidad de antígeno dual fuera obsoleta .
A pesar de todo, estos estudios abordaron los principales desafíos teóricos asociados con el objetivo de la molécula CD30. En primer lugar, los niveles elevados de CD30 soluble están presentes en el plasma de los pacientes con LH y LCA, lo que plantea preocupaciones de competencia para la unión al CAR . Sin embargo , los estudios in vitro demostraron que los niveles elevados de CD30 soluble no afectaban negativamente la actividad de las células CAR-T dirigidas a CD30, probablemente porque el epítopo objetivo del CAR no se retiene en la forma soluble de la molécula o porque se requieren múltiples moléculas inmovilizadas para activar la señalización del CAR.
En segundo lugar, estos estudios exploraron los niveles de expresión de la molécula CD30 para sensibilizar la destrucción de células CAR-T. CD30 se expresa de forma transitoria por un subconjunto de linfocitos tras la activación, lo que plantea preocupaciones por la eliminación prematura de las células T o B durante las respuestas del virus. Sin embargo , extensos estudios ex vivo han descartado este problema, lo que sugiere que el nivel de regulación ascendente de CD30 en las células T de memoria que responden a la estimulación de antígenos asociados al virus es menor que el presente en las células tumorales y, por lo tanto, es incapaz de activar completamente la maquinaria de destrucción. La detección de antígenos por moléculas de CAR se está convirtiendo en una característica importante, ya que la expresión diferencial de moléculas objetivo entre células normales y tumorales, en última instancia, dictará la selección del scFv para aplicaciones de CAR contra tumores sólidos. Sin embargo, el potencial de las células T-Car dirigidas a CD30 para eliminar las células T alorreactivas o las células T reguladoras (Tregs), que parecen expresar CD30 a un nivel significativamente más alto, aún no se ha explorado por completo, y puede abrir este enfoque a otras aplicaciones en el campo del trasplante de células madre.
Un último aspecto importante abordado en estos estudios preclínicos se ocupó de la resistencia de algunas células CD30+ a la muerte mediada por células CAR-T. CD30 se expresa de hecho por células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) durante la activación, lo que potencialmente conduce a trastornos de hematopoyesis, incluida la aplasia de la médula ósea. Sin embargo , al comparar la potencia de las células T-Car dirigidas a CD30 con las células HSPCs CD30+ y las células de linfoma cutáneo de células T MyLa CD30+, se observó una actividad mínima frente a las primeras. Además, las HSPC que se clasificaron en células CD30+ y CD30-mostraron solo una citólisis ligeramente superior en presencia de células CAR-T, que sin embargo fue mucho menor en comparación con la lisis de las células de linfoma MyLa . Las HSPCS que se cocultivaron con células CAR-T dirigidas a CD30 también tuvieron una formación normal de colonias mieloides, con solo una ligera disminución en la formación de colonias eritroides. Es importante destacar que la transferencia adoptiva de células T-Car dirigidas a CD30 autólogas durante la reconstitución de la HSPC en ratones humanizados no produjo deterioro en las células T y B periféricas humanas, lo que sugiere una hematopoyesis preservada y confirma la falta de toxicidad significativa en la médula ósea.
Además de la expresión diferencial de CD30 en HSPCs a un nivel que está por debajo del umbral para la activación de células CAR-T, parece probable que haya cierta resistencia intrínseca de las células progenitoras. Las HSPC expresan niveles más altos de proteasa de serina SP6/PI-9 que inactiva la granzima B, un importante facilitador de la apoptosis mediada por células T. Aunque diferentes células usan estrategias diferentes, esta observación es consistente con estudios en células embrionarias y tumores que, a pesar de expresar CD30, son más resistentes a la destrucción de células CAR-T.
Ensayos clínicos de células CAR-T dirigidas a CD30
Hasta la fecha se han publicado dos ensayos de células CAR-T dirigidas a CD30, y ambos ensayos muestran que este tratamiento es bien tolerado con cierta actividad antitumoral (Tabla 1). Los dos estudios utilizaron diferentes scFv, señales costimulatorias, sistemas de administración, regímenes de preparación y dosis, lo que dificultó la realización de comparaciones y, al mismo tiempo, proporcionó escenarios amplios de función.
Wang et al. se trató a 18 pacientes con linfoma CD30+ recidivante/refractario (17 con LH y 1 con LCA cutáneo) con un CAR anti-CD30 . Este CAR (derivado del anticuerpo AJ878606.1) utilizó el endodominio costimulatorio 4-1BB y un vector lentiviral para la ingeniería de células T. De los 18 pacientes tratados, 9 habían recibido un TCMC previo y 5 habían sido tratados con VB. Los pacientes recibieron una dosis media de 1.56 × 107 células T-CAR / kg después de un régimen de agotamiento linfático, que consta de 3 combinaciones diferentes, lo que causó cierto grado de citopenias . Todos los pacientes tuvieron una reacción febril a la perfusión de grado 1 o 2 (fiebre y escalofríos) que se recuperó durante la noche. Solo hubo dos toxicidades de grado 3 o superiores: un paciente presentó anomalías en las pruebas de función hepática que se consideraron secundarias a la toxicidad por agotamiento linfático y un paciente presentó disfunción sistólica, probablemente relacionada con la exposición previa a antraciclinas. No hubo síndrome de liberación de citoquinas.
De los 18 pacientes tratados y evaluables para la respuesta, 7 pacientes tuvieron una respuesta parcial (RP) y 6 pacientes tuvieron enfermedad estable (MS) después de la perfusión No hubo RC y la TRG fue del 39%. La mediana de la supervivencia libre de progresión fue de 6 meses, con 4 pacientes con respuesta continuada en el momento de la publicación. Hubo 5 pacientes que recibieron una segunda infusión de células CAR-T, con 3 pacientes que mantuvieron la RP después del 2º tratamiento, 1 paciente que mantuvo la MS y 1 paciente que obtuvo una RP después de ser evaluado como con MS después de la 1ª infusión. Los ganglios linfáticos parecían responder mejor al tratamiento que la enfermedad extraganglionar, y las lesiones pulmonares parecían responder menos al tratamiento, aunque es difícil sacar conclusiones con un tamaño de muestra tan pequeño.
En la mayoría de los pacientes tratados, los niveles de transgenes CAR en la sangre periférica alcanzaron su máximo a los 3-9 días después de la perfusión y disminuyeron al valor basal a las 4-8 semanas después de la perfusión, se encontraron un mayor número de transgenes CAR y una disminución del número de células tumorales CD30+ en los pocos pacientes a los que se les realizaron biopsias tumorales en ese momento, lo que sugiere que las células CAR-T funcionales se trasladaron a los sitios tumorales.
Ramos et al. se notificaron los resultados de 9 pacientes con linfoma CD30+ recidivante/refractario (6 con LH, 1 con LCA ALK negativo cutáneo, 1 con LCA ALK+ sistémico y 1 con LBDL evolucionado a LH) . Para este ensayo, el CAR CD30 (derivado del anticuerpo HSR3) se combinó con un endodominio coestimulador CD28 y se administró a las células T a través de un vector antirretroviral gammaretal . De los 9 pacientes tratados, 8 tenían enfermedad activa en el momento de la infusión celular. Todos los pacientes fueron pretratados en gran medida y habían recaído después de 3 o más líneas de tratamiento previas, 7 habían sido tratados previamente con VB y 6 habían recaído después de un TCMC.
Los pacientes recibieron hasta 2 × 108 células T-Car dirigidas a CD30/m2 sin un régimen de eliminación linfática administrado antes de la perfusión . El tratamiento fue bien tolerado, sin toxicidad atribuible a las células T-CAR ni episodios de síndrome de liberación de citoquinas notificados. Los autores también monitorearon la inmunidad de las células T a los antígenos virales antes y después de la infusión y no encontraron diferencias en la respuesta de las células T a los patógenos virales comunes . Además, no se notificaron infecciones virales después del tratamiento con células T-CAR CD30.
de 8 pacientes tratados que tenían enfermedad activa en el momento de la infusión, 2 pacientes fue en CR con 1 paciente con ALK+ ALCL mantenimiento de CR 9 meses antes de la recaída, y el otro paciente con HL, continuando en CR por más de 2.5 años en el momento de la publicación . Tres pacientes tenían MS y 3 pacientes tenían enfermedad progresiva. El único paciente tratado que ya estaba en RC en el momento de la infusión después de recibir quimioterapia de rescate después del TCMC ha mantenido una RC durante más de 2 años en el momento de la publicación. La mayoría de las respuestas se observaron en pacientes que recibieron la dosis más alta. Hubo una expansión dosis-dependiente de las células T-CAR en sangre periférica y los niveles alcanzaron su punto máximo dentro de la semana de la perfusión y disminuyeron después, pero las señales de CAR seguían siendo detectables 6 meses después de la perfusión en 6 pacientes .
A pesar de que ambos estudios demostraron una buena tolerabilidad y algunos efectos, los resultados son modestos en comparación con los obtenidos con células T-Car dirigidas a CD19. Actualmente hay varios ensayos clínicos en curso con diferentes construcciones de células CAR-T CD30 en linfomas recidivantes o refractarios que abordan formas de mejorar el desenlace (Tabla 2).
Las futuras direcciones de las células T CAR dirigidas a CD30
Las estrategias de disección para mejorar las células T CAR de CD30 deben ser escalonadas y multifacéticas.
En primer lugar, se deben considerar a fondo los regímenes que agotan el linfocito (Fig. 1a). La quimioterapia de acondicionamiento o de agotamiento linfático administrada antes de la infusión de células CAR-T mejora claramente la persistencia y la eficacia de las células CAR-T dirigidas a CD19 . La quimioterapia que agota los linfocitos reduce la carga tumoral del paciente y el número de células supresoras . El microambiente del LH, en particular, tiene numerosas células inhibidoras, como Tregs, células T colaboradoras de tipo 2 y macrófagos asociados a tumores (TAM) , que apoyan la supervivencia de las células Hodgkin Reed Sternberg (HRS), las células malignas del LH . Por lo tanto, en el LH, el agotamiento linfático puede, además, hacer que las células del linfoma sean más susceptibles a la eliminación de las células CAR-T al interrumpir este microambiente inhibitorio. Finalmente, el agotamiento linfático elimina las células sumideras competidoras, lo que hace que las citocinas IL-7 e IL-15 estén disponibles rápidamente para la expansión de las células CAR-T.
a. La quimioterapia que agota los linfocitos reduce el número de células supresoras, como las células T reguladoras y las células auxiliares de tipo 2, que pueden perturbar el microambiente tumoral. También estimula la producción de citocinas, como la IL-7 e IL-15, que pueden promover la expansión de las células CAR-T. b. Las células de Hodgkin Reed-Sternberg producen timo y quimiocina/CC regulada por activación ligando quimiocina 17 (TARC/CCL17) y quimiocina derivada de macrófagos (MDC / CCL22), que atraen células auxiliares de tipo 2 y células T reguladoras que expresan CCR4. Las células CAR-T diseñadas para expresar CCR4 pueden haber mejorado el tráfico al sitio del tumor. c. Se ha encontrado que las células CAR-T anti-CD30 expresan PD-1, lo que sugiere que pueden ser susceptibles a la vía PD-1/PD-L1 que conduce a la inhibición inmunitaria. Además, las células de Hodgkin Reed-Sternberg también expresan PD-L1, lo que puede tener un efecto inhibitorio en las células CAR-T que expresan PD-1. Los inhibidores de puntos de control pueden interrumpir la vía PD-1/PD-L1 y conducir a una mejor expansión y persistencia de las células CAR-T. Los factores de crecimiento, como el factor estimulante de colonias 1 (CSF1), estimulan los macrófagos asociados a tumores (TAM) para que sean antiinflamatorios y promuevan el desarrollo tumoral. Las combinaciones con inhibidores del receptor CSF1 (CSF1R) podrían ayudar a interrumpir el microambiente tumoral inhibitorio y mejorar la eficacia de las células CAR-T
Se desconoce el régimen óptimo de agotamiento linfático que se utilizará con las células T-CAR CD30. En su ensayo clínico de células T-CAR dirigidas a CD30, Wang et al. se trató a pacientes con 1 de 3 regímenes de acondicionamiento diferentes (que consistían en fludarabina y ciclofosfamida, o gemcitabina, mustargeno y ciclofosfamida, o paclitaxel y ciclofosfamida de nab -), pero no se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre ellos . Muchos estudios en curso utilizan fludarabina y ciclofosfamida como agotamiento linfático, extrapolando datos de ensayos clínicos CAR-T dirigidos a CD19 (ver Tabla 2; NCT02259556, NCT02917083, NCT03049449). Un régimen alternativo explorado combina fludarabina y bendamustin como agotamiento linfático (NCT02690545). Otro enfoque consiste en infundir a los pacientes células T-CAR CD30 como consolidación después de un TACM. En este escenario, el TACM actúa como el régimen de agotamiento linfático definitivo, lo que lleva a niveles altos de citocinas estimulantes como la IL-7 e IL-15 que pueden apoyar la expansión de las células T-CAR y eliminar las células linfoides supresoras . Hay un ensayo clínico en curso de células T-Car dirigidas a CD30 como consolidación después de un TCMC en pacientes con linfomas CD30+ (NCT02663297).
Otro aspecto importante a tener en cuenta para las neoplasias malignas CD30 es la localización de la enfermedad (Fig. 1b). Los linfomas son principalmente una enfermedad de los tejidos linfoides (ganglios linfáticos y médula ósea), pero los tumores CD30+ presentan desafíos adicionales. En el LH, el entorno de quimiocinas es muy importante para influir en las células que se acumulan en el tumor . Las células HRS producen el ligando 17 de quimiocina/CC regulada por activación y timo (TARC / CCL17) y quimiocina derivada de macrófagos (MDC/CCL22). Estas quimiocinas atraen a las células que expresan su receptor afín, CCR4, como las células auxiliares de tipo 2, Tregs y las células supresoras derivadas mieloides (MDSC) . La infiltración de estas células protege a las células HRS al crear, no solo un entorno supresor, sino también una barrera física para el acceso de los linfocitos T citotóxicos. Para garantizar el tráfico preferencial a las células de LH, Savoldo et al. células T creadas que, además de expresar el CAR CD30, también coexpresan el receptor de quimiocina, CCR4 . Encontraron que las células CAR-T dirigidas a CD30 que expresaban CCR4 habían mejorado la migración al tumor y aumentado la actividad anti-linfoma en comparación con las células CAR-T dirigidas a CD30 que no expresaban CCR4 en modelos de ratones con LH . Una preocupación acerca de este enfoque es que el TARC y el MDC son producidos por otros tejidos, como la piel, lo que podría aumentar la toxicidad. Sin embargo, dado que el CD30 no se expresa en estos sitios, las células CAR-T dirigidas al CD30 no deben causar toxicidad tumoral en el blanco. En cambio, las células CAR-T dirigidas a CD30 que coexpresan CCR4 también podrían ser más efectivas en linfomas cutáneos CD30+ debido a un mayor tráfico a la piel. Se planea abrir en un futuro cercano un ensayo clínico de células T-Car dirigidas a CD30 coexpresoras de CCR4 en pacientes con linfomas CD30+ recidivantes o refractarios.
Como se describió anteriormente, el entorno tumoral de los linfomas y el LH, en particular, es rico en células y moléculas inhibidoras. Por lo tanto, es imperativo considerar asociar el CD30 del automóvil con otros reguladores inmunitarios. Entre las estrategias candidatas, los inhibidores de puntos de control inmunitarios (Is, Fig. 1c) son la clave. Esto es especialmente interesante en el LH, donde lasIs han mostrado una excelente actividad de agente único . Además, Ramos et al. se encontró que la PD1 se expresaba en 33% de las células CAR-T dirigidas a CD30 infundidas , lo que indica que estas células seguirán siendo susceptibles a la vía inhibitoria de PD1/PDL1 una vez en el sitio del tumor. En los informes de casos de pacientes que progresaron después de recibir células T-Car dirigidas a CD19 y que posteriormente fueron tratados con pembrolizumab, se observó una nueva expansión de células T-Car CD19 y respuesta clínica . Sin embargo, es necesario identificar el momento y la secuencia óptimos de la combinación paraIs y células T-CAR CD30. Además, se desconoce el efecto de esta combinación sobre los efectos adversos relacionados con el sistema inmunitario y el síndrome de liberación de citoquinas. Alternativamente, con los avances en ingeniería genética, la regulación selectiva a la baja de los receptores inhibitorios por parte de las células T con CAR representa alternativas interesantes .
La presencia de MDSC y su papel en la protección de tumores en el LH también requiere pruebas de combinaciones con nuevos moduladores, como inhibidores del receptor del factor 1 estimulante de colonias (CSF1R), ya que las MDSC expresan CSF1R . Además, los factores de crecimiento, como el CSF1, estimulan a los macrófagos asociados al tumor para que sean antiinflamatorios, o el fenotipo M2, y promueven el crecimiento tumoral . Aumento del número de macrófagos asociados a tumores se asocia con peor pronóstico en HL . Esto apoya aún más la justificación de los inhibidores de CSF1R en el LH y los estudios de fase I sobre inhibidores de CSF1R se han probado en el LH y muestran una buena tolerancia pero una eficacia limitada . Sin embargo, las combinaciones con células T CD30CAR pueden resultar beneficiosas.