Efectos antivenenos de 1,2,3-Triazoles contra serpientes Bothrops jararaca y Lachesis muta

Resumen

Los venenos de serpientes son mezclas complejas de proteínas de enzimas y no enzimas, que son responsables de producir varios efectos biológicos. La intoxicación humana por mordeduras de serpientes, particularmente las de la familia viperidae, induce un cuadro fisiopatológico complejo caracterizado por cambios espectaculares en la hemostasia y, con frecuencia, también se observa hemorragia. El presente trabajo reporta la capacidad de seis de una serie de derivados de 1,2,3-triazol para inhibir algunos efectos farmacológicos causados por los venenos de Bothrops jararaca y Lachesis muta. Los ensayos in vitro mostraron que estos compuestos estaban alterados de manera dependiente de la concentración, el fibrinógeno o la coagulación plasmática, la hemólisis y la proteólisis producidas por ambos venenos. Además, estos compuestos también inhibieron los efectos biológicos in vivo. Los ratones tratados con estos compuestos estaban completamente protegidos de las lesiones hemorrágicas causadas por dichos venenos. Pero, sólo la B. la actividad inducida por edema de jararaca fue neutralizada por los triazoles. Por lo tanto, el efecto inhibitorio de los derivados de triazoles contra algunos ensayos biológicos in vitro e in vivo de venenos de serpiente apunta a aspectos prometedores que pueden indicarlos como modelos moleculares para mejorar la producción de antivenenos efectivos o para complementar la neutralización de antivenenos, especialmente los efectos patológicos locales, que son parcialmente neutralizados por los antivenenos.

1. Introducción

Los venenos de serpiente son mezclas complejas de proteínas que incluyen enzimas (metaloproteinasas, proteinasas de serina, fosfolipasas A2 y L-aminoácido oxidasa) y proteínas sin actividad enzimática, como desintegrinas, lectinas de tipo C, toxinas de proteínas secretoras ricas en cisteína (crujientes), péptidos natriuréticos y miotoxinas. Las víboras venenosas Bothrops jararaca y Lachesis muta son responsables de accidentes que involucran a seres humanos en varias regiones de América del Sur. Mientras que B. jararaca se encuentra en el sur de Brasil, Paraguay y el norte de Argentina, L. muta se distribuye en los bosques ecuatoriales al este de los Andes, desde el este de Ecuador, Colombia, Perú, el norte de Bolivia y el este y norte de Venezuela, hasta Guyana, Guyana Francesa, Surinam y el norte de Brasil. Dentro de su área de distribución, a menudo son abundantes y son causa importante de mordeduras de serpientes . El envenenamiento por estas serpientes se caracteriza principalmente por efectos sistémicos (sangrado generalizado, coagulopatía, insuficiencia renal y shock) y locales (hemorragia, edema y necrosis) . Como se informó en otros lugares, las mordeduras de serpientes constituyen un problema de salud pública en América Latina y en otros países tropicales y subtropicales, en los que se consideran un problema de salud descuidado, según la Organización Mundial de la Salud (OMS) . En América del Sur, B. jararaca induce una mayor incidencia de picaduras (95%) que L. muta (alrededor del 2%); sin embargo, las picaduras de L. muta generalmente conducen a síntomas de envenenamiento más graves y su incidencia de letalidad es tres veces mayor que B. jararaca . Hoy en día, la administración parenteral de antídotos de origen animal es el único tratamiento específico para la intoxicación por mordeduras de serpiente. En Brasil, la administración intravenosa de antídoto polivalente de Bothrops se usa para tratar los casos de envenenamiento causados por picaduras de Bothrops o el suero laquético y bothrops polivalente para mordeduras de serpientes de L. muta y Bothrops (B. atrox) en las regiones amazónicas. Como se indicó anteriormente, los envenenamientos moderados a severos infligidos por las serpientes Bothrop y Lachesis se caracterizan por una serie compleja de alteraciones locales y sistémicas, como hemorragia, mionecrosis, coagulopatía, shock cardiovascular, insuficiencia renal y, finalmente, muerte . Según lo informado por otros autores, a pesar de ser seguros, las dosis altas de antivenenos que a veces se usan en Brasil para tratar a pacientes con envenenamiento de Bothrop/Lachesis probado o sospechoso pueden contribuir a reacciones anafilácticas tempranas y tardías (enfermedad del suero). Por lo tanto, la producción de antivenenos de calidad adecuada presenta un desafío considerable. Además, los precios de los antivenenos han aumentado y algunos países han dejado de fabricarlos . Algunos antivenenos neutralizan de manera eficiente los efectos tóxicos sistémicos del veneno; sin embargo, los efectos locales no se bloquean y esta situación puede llevar a la amputación o discapacidad .

Debido a estos problemas, se han buscado tratamientos alternativos y algunos de ellos han implicado la búsqueda de nuevas moléculas capaces de neutralizar los efectos sistémicos y locales de los venenos. Se han probado extractos de plantas y otras fuentes naturales (como los de organismos marinos) para determinar su capacidad de neutralizar una variedad de efectos biológicos y tóxicos del veneno de serpiente. Se han identificado varias moléculas farmacológicamente activas, y ya se han enumerado muchos efectos para ellas, incluida su capacidad antivenínica . Hoy en día, se están investigando muchos enfoques nuevos de bioprospección. Sin embargo, en relación con esto, cabe señalar que hasta el momento no se han explorado bien los efectos biológicos de las moléculas derivadas de la síntesis orgánica. La literatura ha descrito el compuesto 1,2,3-triazol como una clase importante de sistema heterocíclico nitrogenado de cinco miembros que presenta diferentes perfiles farmacológicos, como actividad antiagregante plaquetaria , anticoagulación , antiviral , tripanocida , antimicrobiana y/o su uso en el tratamiento de la esquizofrenia y la leishmaniasis . Hay dos métodos generales disponibles para la construcción de anillos de 1,2,3-triazol: Reacciones de cicloadición dipolar de Huisgen 1,3 , en particular la cicloadición catalizada por cobre(I), y la electrocicclización intramolecular de 1,5 compuestos β-sustituidos-α-diazocarbonilo . Nuestros estudios previos han indicado que seis nuevos compuestos sintéticos de 1,2,3-triazol (ésteres etílicos de ácido 1-arilsulfonilamino-5-metil-1H tri triazol-4-carboxílico) inhibieron la hemólisis inducida por el veneno de L. muta . De hecho, tales derivados mostraron una amplia gama de actividades farmacológicas .

El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de estos seis derivados de 1,2,3-triazol basados en –1-(p-clorofenil)-1H tri triazol-4-carbohidrazida contra las actividades in vivo e in vitro de los venenos Bothrops jararaca y Lachesis muta.

2. Material

2.1. Veneno y Material

Bothrops jararaca, Lachesis muta, venenos liofilizados y antiveneno anti-Lachesis o anti-Bototrópico fueron proporcionados por Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasil, y almacenados a -20°C hasta los ensayos. Dimetilsufóxido (DMSO), fibrinógeno bovino y azocaseína se obtuvieron de Sigma Chemical Co. Todos los demás reactivos eran del mejor grado disponible.

2.2. Derivados sintéticos

Los seis derivados de ésteres etílicos del ácido 1-arilsulfonilamino-5-metil-1H tri triazol-4-carboxílico se sintetizaron de acuerdo con nuestro informe anterior y sus estructuras químicas se muestran en la Figura 1. Estos compuestos se disolvieron en dimetilsufóxido (DMSO) y se almacenaron a 4°C, hasta que fue necesario.

Figura 1

estructuras Químicas de los seis 1,2,3-triazoles derivados N’–1-(p-clorofenil)-1H–triazol-4-carbohidrazida. Las seis derivadas se diseñaron como números, como se muestra en el paréntesis después de cada derivada.

2.3. Animales

Se obtuvieron ratones BALB/c (18-20 g) del Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) de la Universidad Federal Fluminense. Los animales fueron alojados en condiciones controladas de temperatura (°C) y luz. Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética en Experimentación Animal de la UFF (protocolo número 297) que estaban de acuerdo con las directrices del Comité Brasileño de Experimentación Animal (COBEA) y las leyes y políticas internacionales.

3. Métodos

3.1. Inhibición de la Hemólisis Indirecta

El grado de hemólisis causado por los venenos de L. muta y B. jararaca se determinó mediante la prueba hemolítica indirecta utilizando eritrocitos humanos y emulsión de yema de huevo de gallina como sustrato . La cantidad de L. muta y B. el veneno de jararaca (µg / mL) que produjo hemólisis al 100% se denotó como dosis hemolítica indirecta mínima (MIHD). Se realizaron experimentos inhibitorios incubando derivados de triazol con un MIHD durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se evaluó la actividad hemolítica. Los experimentos de control se realizaron incubando venenos con DMSO o solución salina.

3.2. Actividad anticoagulante

La actividad de coagulación de los venenos de L. muta y B. jararaca se determinó utilizando un coagulómetro digital Amelung, modelo KC4A (Labcon, Alemania). Diferentes concentraciones de L. el veneno de muta (10 µg/ml) y B. jararaca (40 µg/mL) se mezcló con solución de fibrinógeno bovino (2 mg/ml) o con plasma humano, y la cantidad de veneno que coaguló el fibrinógeno o el plasma en 60 segundos se denotó como dosis mínima de coagulante (MCD). Para evaluar su efecto inhibidor, los derivados de triazol se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con una MCD de venenos, y luego se añadió la mezcla al fibrinógeno o plasma y se registró el tiempo de coagulación. Los experimentos de control se realizaron en paralelo mediante la adición de DMSO o solución salina incubada con veneno, en lugar de los triazoles.

3.3. Actividad antiproteolítica

La actividad proteolítica de los venenos de L. muta y B. jararaca se determinó utilizando azocaseína como sustrato (0,2% p / v, en 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), con pequeñas modificaciones . Una concentración efectiva (CE) se definió como la cantidad de veneno (µg/mL) capaz de producir una variación a 420 nm de aproximadamente 0,2. Los derivados de triazol se incubaron con un CE de veneno durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se midió la proteólisis. Los experimentos de control se realizaron incubando venenos con DMSO o solución salina.

3.4. Actividad antihemorrágica

Las lesiones hemorrágicas producidas por los venenos de L. muta y B. jararaca se cuantificaron mediante un procedimiento descrito por Kondo et al. , con modificaciones. Brevemente, las muestras se inyectaron intradérmicamente (i.d.) en la piel abdominal de ratones. Dos horas más tarde, los animales fueron sacrificados por decapitación, se les extirpó la piel abdominal, se estiraron y se inspeccionaron para detectar cambios visuales en el aspecto interno con el fin de localizar las manchas hemorrágicas. La hemorragia se cuantificó como la dosis hemorrágica mínima (MHD), definida como la cantidad de veneno (mg/kg) capaz de producir un halo hemorrágico de 10 mm. Se investigó el efecto inhibitorio de los derivados de triazol incubando compuestos con dos MHD de veneno de L. muta o B. jararaca durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se inyectó la mezcla en ratones y se midió la hemorragia. La actividad hemorrágica se expresó como el diámetro medio (en milímetros) del halo hemorrágico inducido por venenos en ausencia y presencia de derivados triazólicos. Los experimentos de control negativo se realizaron inyectando DMSO o solución salina.

3.5. La actividad antiedematogénica

La actividad inducida por edema de los venenos de L. muta y B. jararaca se determinó de acuerdo con Yamakawa et al. , con modificaciones. Grupos de cinco ratones se inyectaron subcutáneamente (s. c) en la almohadilla derecha del pie con 50 µL de veneno, mientras que la almohadilla izquierda recibió 50 µL de solución salina. Una hora después de la inyección, se evaluó el edema y se expresó como el porcentaje de aumento en el peso de la almohadilla del pie derecho en comparación con la izquierda. Se investigó el efecto inhibitorio de los derivados de triazol incubando compuestos con veneno de L. muta o B. jararaca durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se inyectó la mezcla en ratones (almohadilla para el pie derecho) y se midió el edema.

3.6. Análisis estadístico

Los resultados se expresan como medias ± SEM obtenidas con el número indicado de animales o experimentos realizados. La significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales se evaluó mediante la prueba de Estudiante. Se consideró significativo un valor ≤ 0,05.

4. Resultados y Discusión

El desarrollo de antivenenos eficaces, seguros, más baratos y más accesibles merece atención, ya que las mordeduras de serpientes también pueden causar discapacidades graves y matar a miles de personas. Un número creciente de estudios se han centrado en la búsqueda de inhibidores de venenos de serpientes de una variedad de fuentes, ya sean naturales o sintéticas . La suramina y el benzoilo fenil benzoato son moléculas sintéticas capaces de inhibir la miotoxicidad, la coagulación y las actividades de la fosfolipasa A2 y la hialuronidasa de venenos de serpientes de diferentes familias. Los análogos de la lactona se sintetizaron e inhibieron la miotoxicidad, y las actividades enzimáticas e inductoras de edema inducidas por una fosfolipasa A2 aislada de B. jararacussu . Por otro lado, los principios bioactivos marinos también han atraído la atención debido a su amplia difusión de las acciones farmacológicas .

En este trabajo, se evaluó la capacidad de seis ésteres etílicos de ácido 1-arilsulfonilamino-5-metil-1H tri triazol-4-carboxílico para neutralizar algunas actividades in vitro (hemólisis, coagulación y proteólisis) e in vivo (hemorragia y edema) causadas por B. jararaca y L. venenos de muta, ya que los resultados anteriores indicaron que estos seis derivados inhibían la hemólisis inducida por el veneno de L. muta, pero con potencias diferentes . Por esta razón, se pensó que valdría la pena investigar las acciones de estos derivados sobre otras actividades biológicas importantes relacionadas con las mordeduras de serpientes, como la proteólisis, la coagulación, la hemólisis, la hemorragia y el edema. Se demostró que estos compuestos inhibían la hemólisis causada por el veneno de B. jararaca (50 µg/mL) y L. muta (15 µg/mL) (Figura 2(a)). El porcentaje inhibitorio de los derivados fue superior al 50% frente a ambos venenos. Sin embargo, se observó una ligera diferencia en el perfil inhibitorio para el derivado 6, donde se logró una inhibición del 50% y 90% de la hemólisis para el veneno de B. jararaca y L. muta, respectivamente. Ni los derivados ni el DMSO llevaron a los eritrocitos a hemólisis, ni el DMSO interfirió en el grado de hemólisis causado por los venenos.

(un)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Efecto de los derivados en la hemólisis y la proteólisis. Los derivados 1-6 (45 µM) se incubaron con B. jararaca (columnas oscuras) o con L. muta (columnas discontinuas) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se realizaron actividades hemolíticas (a) y proteolíticas (b). Los datos se expresan como media ± SEM de experimentos individuales ().

La intoxicación por estas mordeduras de serpiente produce una hemorragia severa debido al alto contenido de metaloproteasa dependiente de zinc o serina proteasa que digiere componentes proteicos de la matriz extracelular o consume factores de coagulación de la sangre . B. jararaca y L. el veneno de muta hidrolizó azocaseína de forma dependiente de la concentración con una CE de 20 µg/mL y 6 µg/mL, respectivamente (no se muestran los datos). Los derivados inhibieron la proteólisis inducida por B. jararaca o L. muta (Figura 2 (b)). Los derivados 1, 2, 3 y 6 inhibieron la proteólisis inducida por ambos venenos hasta un 80% y el derivado 5 inhibió dicha actividad por debajo del 50%. Se observó una marcada diferencia en el perfil inhibitorio de los derivados para el derivado 4, en el que inhibió el 97% y el 25% de la proteólisis inducida por el veneno de B. jararaca o L. muta, respectivamente (Figura 2(b)).

Como se ve en la Figura 3, derivados 1, 2, 4, 5 y 6, pero no el derivado 3 inhibe de manera dependiente de la concentración (23-94 µM), la coagulación del fibrinógeno inducida por los venenos de B. jararaca (40 µg/ml) o L. muta (10 µg/mL). Parecía que los derivados inhibían más eficientemente la coagulación inductora de L. muta que B. jararaca. A la concentración más alta (94 µM), los derivados 1, 2, 3, 5 y 6 impidieron la coagulación de L. muta (Figura 3(b)), mientras que los derivados 2 y 6 impidieron la formación de B. jararaca una vez (Figura 3(b)). A concentraciones de hasta 200 µM, todos los derivados del 1,2,3-triazol previnieron eficazmente la coagulación del fibrinógeno causada por ambos venenos, pero a concentraciones inferiores a 10 µM, ninguno de estos compuestos previno la coagulación. Sin embargo, cuando los derivados (10 µM) se juntaron e incubaron con veneno de B. jararaca o L. muta, el tiempo de coagulación se retrasó dos veces. Se observó que, si se eliminaba el derivado 2 o 6 de la mezcla, no se observaba un efecto inhibitorio sobre la coagulación. Además, los derivados también previnieron la coagulación inducida por venenos cuando se utilizó plasma. Ni el DMSO (1% v/v, concentración final) ni la solución salina interfirieron con los procesos de coagulación.

(a)
(un)

(b)

(a)
(a)
(b)

Figura 3

Efecto de los derivados sobre el fibrinógeno de la coagulación. Veintitrés derivados de µM (columnas grises), 46 µM (columnas blancas) o 94 µM (columnas negras) se incubaron con 40 µg/ml de B. jararaca (a) o con 10 µg/ml de L. muta (b) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la mezcla al fibrinógeno (2 mg/ml) y se registró el tiempo de coagulación. Los venenos se incubaron con solución salina (C1); DMSO al 1% v/v (C2); derivado 1 (columna 1); derivado 2 (columna 2); derivado 3 (columna 3); derivado 4 (columna 4); derivado 5 (columna 5); y con derivado 6 (columna 6). # significa que el fibrinógeno no coaguló hasta 600 segundos de observación. Los datos se expresan como media ± SEM de experimentos individuales ().

La inyección intradérmica de veneno de B. jararaca (12 mg/Kg) o L. muta (20 mg/Kg) produjo un halo de hemorragia de 20 mm en ratones. Tal halo representa dos MHD de venenos. Cuando cada veneno se mezcló con derivados (90 µM) y luego se inyectó en ratones, se observó una protección completa contra la hemorragia (no se muestran los datos). En contraste, los resultados anteriores mostraron que el suero antilaquético no inhibía la hemorragia inducida por el veneno de L. muta . La inyección de DMSO, derivados o solución salina no produjo hemorragia. La inducción de edema es otro efecto importante que sigue a la mordedura de serpiente . La Figura 4 muestra que el edema inducido por 5 mg/Kg de B. jararaca (Figura 4(a)) u 8 mg/Kg de L. la muta(figura 4 b)) se redujo significativamente con los derivados (90 µM). Los derivados triazólicos 1, 2 y 4 inhibieron por encima del 80% el edema inducido por B. jararaca, mientras que los derivados 3, 5 y 6 inhibieron alrededor del 70% (Figura 4(a)). Como se ha visto, todos los derivados inhibieron menos la actividad edematogénica inducida por L. muta(Figura 4 (b)).

(un)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

Efecto de los instrumentos derivados en el edema de inducción de la actividad. Los derivados (90 µM) se incubaron con 5 mg/Kg de B. jararaca (a) o con 8 mg/Kg de L. muta (b) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se realizó actividad inducida por edema. Las columnas son la derivada 1 más veneno (1); la derivada 2 más veneno (2); la derivada 3 más veneno (3); la derivada 4 más veneno (4); la derivada 5 más veneno (5) y la derivada 6 más veneno (6). Los datos se expresan como media ± SEM de experimentos individuales ().

En conclusión, los derivados de ésteres etílicos de ácido 1-arilsulfonilamino-5-metil-1H tri triazol-4-carboxílico pueden ser útiles como prototipos para diseñar nuevas moléculas que mejoren el tratamiento actual utilizado para las mordeduras de serpientes de B. jararaca y L. muta. La potencia inhibitoria de estos derivados puede variar o puede aumentar cuando se juntaron, probablemente actuando sinérgicamente. Por lo tanto, se necesitaría una menor concentración de ellos para lograr una neutralización completa de los efectos biológicos causados por los venenos de B. jararaca y L. muta. Además, ya se ha realizado un análisis previo de la relación estructura-actividad de los derivados . Los derivados se sometieron al análisis de la «regla de los cinco de Lipinski» que indica que una molécula química podría ser un fármaco activo por vía oral en humanos y dicha regla establece que una molécula que viole dos de las siguientes reglas es probable que sea mal absorbida: (1) peso molecular inferior a 500 Da, (2) número de donantes de enlaces de hidrógeno (grupos OH o NH) igual o inferior a 5, (3) número de aceptadores de enlaces de hidrógeno inferior a 10, y finalmente (4) calculado inferior a 5 . Los resultados mostraron que todos los derivados cumplían con esta regla (peso molecular = 296,31–341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 y nHBD = 1-3) apuntando a una buena biodisponibilidad teórica .

Reconocimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Internacional para la Ciencia (IFS Grant F/4571-1) y por las siguientes agencias de financiación brasileñas: Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), Fundación de Amparo a la investigación del Estado de Río De Janeiro Carlos Chagas Filho (FAPERJ), coordinación de perfeccionamiento de personal de Nivel Superior (CAPES), and Universidad Federal Fluminense/Pro-Rectoría de investigación y Posgrado e Innovación (Uff/PROPPi).