El efecto Regulador de la Melatonina sobre las Alteraciones de Citocinas en Ratones Lupus Inducidos por Pristano

Resumen

El lupus eritematoso sistémico (LES) se desarrolla en relación con muchos factores ambientales. En nuestra opinión, es más importante investigar el efecto de la melatonina en el LES relacionado con el medio ambiente. En el presente estudio, se utilizó pristano de 0,5 ml para inducir LES en ratones hembra BALB / c. La melatonina (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) se administró por vía oral inmediatamente después de la inyección de pristano durante 24 semanas. Se detectaron anticuerpos IgM anti ssDNA e histona después de 0, 1, 2, 4, 8 semanas de inyección pristana. Los niveles de IL-2, IL-6 e IL-13 se detectaron después de 24 semanas. También se observaron lesiones renales. Los resultados mostraron que la melatonina antagonizaba los niveles crecientes de anticuerpos anti-ADNss de IgM y autoanticuerpos de histonas. La melatonina también podría disminuir la producción de IL-6 e IL-13 y aumentar la producción de IL-2. Además, la melatonina podría disminuir las lesiones renales causadas por pristane. Estos resultados sugirieron que la melatonina tiene un efecto beneficioso sobre el lupus inducido por pristano a través de la regulación de las alteraciones de las citocinas.

1. Introducción

El lupus eritematoso sistémico (LES o Lupus) es una enfermedad autoinmune que puede atacar el tejido y las células normales del cuerpo, lo que resulta en inflamación y daño tisular . LES ocurre a cualquier edad y en cualquier sexo. Sin embargo, las mujeres son más propensas a tener LES que los hombres . Además, también se han reportado alteraciones en la red de citoquinas en LES, incluyendo IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 e IFN -. Estas citocinas tienen estrechas relaciones con el desarrollo de LES, como la producción de autoanticuerpos y la nefritis de complejo inmunitario. Pero hay algunos resultados contradictorios sobre los cambios de algunas citocinas en diferentes informes.

En los últimos años, se ha prestado cada vez más atención a los factores ambientales que pueden estar implicados en la patogénesis del LES . Las enfermedades autoinmunes son cada vez más comunes en los países industrializados, y estas enfermedades pueden verse influenciadas por factores ambientales . Pristane es un probable candidato como desencadenante ambiental del LES en poblaciones susceptibles. Experimentos con animales mostraron que pristane podría inducir síntomas de enfermedad autoinmune similar al lupus en una cepa de ratones (BALB / c), como niveles altos de autoanticuerpos y glomerulonefritis de complejo inmunitario . Algunas investigaciones epidemiológicas también demostraron que todas las personas con pristane en la sangre tenían enfermedades autoinmunes distintas o síntomas de enfermedades autoinmunes . Además, el pristano que se encuentra en el aceite mineral, el aceite de tiburón y muchos alimentos parece ser una posible exposición ambiental que puede desencadenar el LES. Por lo tanto, podría ser más apropiado investigar los factores ambientales involucrados en el LES utilizando un modelo murino similar al LES inducido por pristanos.

La melatonina es sintetizada y secretada principalmente por la glándula pineal que puede producir receptores específicos dentro y fuera del sistema nervioso central. La melatonina no solo puede afectar directamente la inflamación y las células inmunitarias, sino que también tiene influencias indirectas a través del talamencéfalo . Lo que es más importante, la melatonina se considera una sustancia activa importante en el sistema neuroinmune endocrino . Es capaz de regular el desequilibrio de la red de citoquinas en algunas enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y la artritis adyuvante . Algunos experimentos investigaron sus efectos en ratones MRL-lpr/lpr y mostraron que la melatonina era beneficiosa para el LES espontáneo en ratones hembra . Dado que el medio ambiente es un factor importante en el LES en la sociedad moderna, estábamos más interesados en los efectos de la melatonina en el LES relacionado con el medio ambiente.

Para investigar el papel de la melatonina en el LES, especialmente en el lupus relacionado con el medio ambiente, se utilizaron ratones inducidos por pristano. También se determinaron los efectos de la melatonina en las alteraciones de las citocinas y los siguientes cambios en el modelo de LES inducido por pristano.

2. Materiales y Métodos

2.1. Animales

Sesenta ratones hembra BALB / c de dos meses de edad (g) fueron suministrados por el Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Anhui. Todos los protocolos experimentales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética para la Experimentación Animal del Instituto de Farmacología Clínica de la Universidad Médica de Anhui.

2.2. Materiales

La melatonina se compró a Sigma. Pristano, ADN de timo de ternera desnaturalizado por calor( ADNss), histona total de timo de ternera (histona), concanavalina A (ConA) y lipopolisacáridos (LPS) también fueron de Sigma. Se compraron anticuerpos IgM de conejo y ratón conjugados con biotina y avidina marcada con peroxidasa de rábano picante . Los kits ELISA de interleucina-2 de ratón y los kits ELISA de interleucina-6 se compraron a ADL. Los kits ELISA de interleucina-13 de ratón se compraron a BIOO.

2.3. Protocolos experimentales

Sesenta ratones hembra BALB/c se dividieron aleatoriamente en seis grupos: grupo de control normal, grupo modelo, grupo de tratamiento con prednisona que sirvió como grupo de control positivo y grupos de tratamiento con melatonina (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg), incluidos el grupo de melatonina uno (MT1), el grupo de melatonina dos (MT2) y el grupo de melatonina tres (MT3). A los ratones del grupo control normal se les administró una inyección intraperitoneal de 0.5 ml de solución salina normal (NS) y los demás grupos recibieron una inyección intraperitoneal de pristano de 0,5 ml. Los ratones del grupo control normal y del grupo control modelo recibieron administración intragástrica de NS al día después del primer tratamiento. A los ratones del grupo control positivo se les administró por vía intragástrica 5 mg/kg de prednisona (Pre) al día. Los ratones del grupo MT1 fueron tratados intragástricamente con 0,01 mg/kg de melatonina, MT2 0,1 mg/kg de melatonina y MT3 1,0 mg/kg de melatonina. Se recogieron sueros de la vena de la cola antes del tratamiento (0) y 2, 4 y 8 semanas después del tratamiento para medir el nivel de autoanticuerpos. Veinticuatro semanas después de la administración de pristane, se mataron todos los ratones y se retiraron los bazos para su detección inmunológica; mientras tanto, se examinaron los tejidos nefricos mediante microscopía de luz.

2.4. Se detectaron ensayos de Inmunoabsorción Enzimática (ELISA) para Anticuerpos Anti-ADNss e Histonas

Anticuerpos anti-ADNss e IgM de histonas mediante una técnica de ELISA similar a la descrita en . las placas ELISA de 96 pocillos recubiertas con 10 mg/L de ADNss o antígenos de histonas se incubaron durante la noche a los 4. Al día siguiente, los platos se lavaron con PBS-Tween. Las placas se incubaron con tampón de bloqueo (PBS-2% de albúmina sérica bovina) durante la noche a las 4 y se lavaron con PBS-Tween. Después de incubar durante la noche a las 4 con suero murino diluido a 1 : 250, las placas se lavaron de nuevo y luego se incubaron durante 2 horas a las 4 con anticuerpos IgM antiparasitario de conejo conjugado con biotina diluidos a 1 : 200. Posteriormente, las placas se lavaron e incubaron durante 2 horas a las 4 con avidina marcada con peroxidasa de rábano picante en dilución 1 : 200. Las placas se lavaron de nuevo y se agregaron 100 L de sustrato —tetrametilbencidina (TMB) y solución de peróxido de hidrógeno a los pocillos durante 30 minutos a los 37. La reacción terminó con la adición de 50 L de 2 M de H2SO4 por pocillo. La intensidad del color amarillo se leyó a 490 nm en un lector de microplacas. Los sueros de otros ocho ratones BALB/c normales se recogieron y detectaron al mismo tiempo, y la densidad media y la DE se calcularon para servir de control. Los índices enzimáticos medios (EI) de las muestras en diferentes grupos se calcularon como:

2,5. El cultivo de células del Bazo y la Inducción de Citoquinas

El cultivo de células del Bazo y la inducción de citoquinas fueron modificaciones de los métodos descritos en . En resumen, se prepararon suspensiones unicelulares a partir de bazos extraídos asépticamente de ratones y cultivados en placas de cultivo de 24 pocillos a una concentración final de células/ml. Las células se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con suero fetal de ternera al 10%, glutamina de 2 mm, piruvato de sodio de 1 mM, 2-mercaptoetanol de 50 M y 10 ml de penicilina, estreptomicina y solución antimicótica/L (Sigma). Los cultivos fueron estimulados con 3 mg/L de ConA, 12 mg / L de LPS o medio solo e incubados a 37 en aire humidificado con 5% de CO2. El sobrenadante se recolectó a las 48 h y se conservó a las 20 para ensayos de citoquinas.

2.6. Ensayos de citoquinas

Las concentraciones de interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-13 (IL-13) en el sobrenadante se determinaron utilizando ELISA comercial apropiado para la forma murina de estas citoquinas. La intensidad de cada muestra se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro de microplacas.

2.7. Técnicas histopatológicas

Los riñones recolectados durante el sacrificio de ratones se fijaron durante 24 horas en formalina neutra tamponada antes de la incorporación de parafina. Las secciones se teñieron con Hematoxilina y Eosina y metenamina Jones silver y luego se examinaron bajo un microscopio de luz para determinar la gravedad de la lesión renal. Se observaron glomerulonefritis, lesiones tubulares renales e inflamación intersticial, y se evaluó el grado de gravedad de las lesiones histológicas características de la nefritis lúpica como ausente (), leve (), moderada () y grave ().

2.8. Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como DE. El análisis estadístico se realizó con la prueba t bidireccional de Student, con un nivel mínimo de significancia

3. Resultados

3.1. Efectos de la melatonina sobre los niveles de Anticuerpos Anti-ADNss e Histonas de IgM en Sueros

Los niveles de anticuerpos anti-ADNss e histonas de IgM fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento con inyección de pristano y melatonina (, Figuras 1(a) y 1(b)).

(un)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

los sueros de Los ratones de cada grupo fueron recogidos antes del tratamiento (0), 2, 4 y 8 semanas más tarde, y los niveles de IgM anti-ssDNA y Antihistone se detectaron anticuerpos por ELISA. La EI se calculó de acuerdo con la fórmula. (a) el nivel de anticuerpos anti-ADNss IgM en cada grupo, (b) el nivel de anticuerpos antihistónicos IgM en cada grupo. Los datos se dieron en media±DE (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 frente a sueros a 0 semanas, ∆P<.05, ∆ ∆ P <.01 versus sueros en ratones modelo de control.

Dos semanas después de una única inyección intraperitoneal de pristane, el nivel de anticuerpos anti-ADNss IgM en los sueros comenzó a aumentar obviamente, alcanzó su pico a las 4 semanas, luego comenzó a disminuir y finalmente volvió a la normalidad a las 8 semanas. En el grupo MT1, el nivel de anticuerpos anti-ADNss IgM en los sueros también aumentó y alcanzó su pico a las 4 semanas, pero luego disminuyó de manera más evidente en comparación con el grupo de control del modelo (). En el grupo MT2, el nivel de anticuerpos anti-ADNss IgM en los sueros aumentó durante las primeras cuatro semanas, pero mucho más bajo que el del grupo modelo (), y se mantuvo normal en otros períodos. En el grupo MT3, el nivel de anticuerpos IgM anti-ADNss no aumentó (Figura 1(a)).

Los anticuerpos antihistónicos en sueros aumentaron 1 semana después de la inyección, alcanzaron su pico a las 4 semanas, luego disminuyeron gradualmente y volvieron a la normalidad a las 8 semanas. En el grupo MT1, los niveles de anticuerpos antihistónicos en los sueros fueron significativamente inferiores a los del grupo de control modelo () y volvieron a la normalidad a las 4 semanas. En los grupos MT2 y MT3, los niveles de anticuerpos aumentaron durante las primeras cuatro semanas, pero mucho más bajos que los del grupo modelo (), y se mantuvieron normales en los otros períodos (Figura 1 (b)).

3.2. Efectos de la melatonina en la Producción de citocinas

Para obtener una mejor comprensión de la influencia de la melatonina en las citocinas en LES, se evaluó la producción de citocinas de tipo Th1 y tipo Th2 por parte de esplenocitos estimulados con ConA o LPS durante el curso del lupus murino. Los resultados mostraron que la producción de IL-2, IL-6 e IL-13 cambió en ratones LES inducidos por pristano (Figura 2). La producción de IL-2 de esplenocitos de ratones en el grupo de control modelo fue menor que la de ratones normales (), mientras que la producción de IL-6 e IL-13 de esplenocitos de ratones en el grupo de control modelo fue mayor que la de ratones normales (). En los grupos MT2 y MT3, los niveles de IL-2 estuvieron hasta el nivel normal y fueron más altos que los de los ratones modelo obviamente (), mientras que los niveles de IL-6 e IL-13 fueron más bajos que los de los ratones modelo obviamente (, ) (Figura 2).

(un)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

Todos los ratones fueron sacrificados al final de las 24 semanas, y los linfocitos del bazo fueron sembradas en el 1×106 células/pocillo. Las concentraciones de IL – 2 en linfocitos esplénicos se estimularon durante 48 h con ConA de 3 mg/L. Las concentraciones de IL-6 e IL-13 en linfocitos esplénicos se estimularon durante 48 h con 12 mg/L LPS. Se detectaron concentraciones de IL-2, IL-6 e IL-13 en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Los datos se dieron en media± DE (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 versus grupo control normal, ∆P<.05, ∆ ∆ P <.01 versus grupo de control Modelo.

3.3. Efectos de la melatonina en los Cambios Histopatológicos Renales

Los cambios histopatológicos renales de los ratones se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 3.

(un)

(b)

(c)

d)

(a)
(b)
(c)
d)

Figura 3

Los riñones recogidos en el momento del sacrificio se tiñeron con H&E para el examen histológico. a) Grupo de control normal (HE×200). b) Grupo de control modelo (HE×200). c) Grupo de control modelo (HE×400). d) Grupo MT (HE×200).

Como se muestra en la Figura 3 (a), no se observaron anomalías renales en ratones normales. El volumen y el número de células de los glomérulos eran normales. La pared capilar glomerular era delgada. No se observó yeso de proteína en el túbulo. La infiltración de linfocitos y la proliferación de fibroblastos no se observaron en el intersticial renal.

Como se muestra en las Figuras 3(b) y 3(c) y en la Tabla 1, la mayoría de los ratones inyectados con pristano revelaron anomalías renales que iban de leves a graves. Algunos glomérulos mostraron atrofia glomerular con dilatación de los capilares y engrosamiento de las paredes capilares. Algunas citas revelaron formación de trombo. También se observó ensanchamiento mesangial y aumento de las capas celulares. La pared de la cápsula glomerular era gruesa, y el espacio entre la pared de la cápsula y las células endoteliales desapareció en el glomérulo gravemente afectado. Algunos túbulos renales mostraron dilatación y proliferación de células epiteliales. Se observaron moldes de proteínas en túbulos. Se observó una infiltración de células inflamatorias como monocitos, linfocitos y plasmacitos con agregación focal en el intersticial renal. También se observaron proliferaciones de fibroblastos intersticiales.

Hubo algunas mejoras de diferentes grados en ratones tratados con melatonina (Figura 3(d) y Tabla 1). La atrofia glomerular y el engrosamiento de las paredes capilares se modificaron a un grado leve o moderado. También se mejoró el ensanchamiento mesangial. El espacio entre la pared de la cápsula y las células endoteliales era más pequeño que el de los ratones normales, pero hubo una mejora en comparación con el grupo modelo no tratado. También se observó una ligera infiltración de linfocitos. Algunos túbulos renales mostraron una dilatación leve y algunos moldes de proteínas. Sin embargo, todos los cambios fueron menos severos que los de los ratones modelo.

4. Discusión

En este estudio, se observaron alteraciones inmunitarias en ratones cebados con pristano y los efectos de la melatonina. Dado que los anticuerpos anti-ADN e histonas eran sensibles en el LES , investigamos los cambios de los anticuerpos anti-ADNss y antihistónicos IgM y encontramos altos niveles de autoanticuerpos en los ratones inyectados con pristano. También se encontraron lesiones renales en los ratones. Estos resultados fueron coherentes con los informes anteriores. También encontramos que la melatonina antagonizaba los niveles crecientes de anti-ADNss de IgM y autoanticuerpos de histonas, y la melatonina podría disminuir las lesiones renales causadas por pristane. Pristane es un irritante peritoneal. Es bien sabido que la clase IgM es producida por el subconjunto de células B B1 (CD5+), y el subconjunto B1 está altamente enriquecido en la cavidad peritoneal y se expande en ratones BALB/c , lo que aumenta la posibilidad de que los anticuerpos anti-ADNss y antihistónicos IgM inducidos por el pristano ip se deriven del subconjunto. Estudios previos informaron que la melatonina tenía efectos en la primera respuesta inmunitaria de anticuerpos (IgM, IgG) . Algunos estudios indicaron que la melatonina tenía modulación bidireccional en los linfocitos . Así que pensamos que la melatonina podría mejorar los síntomas del LES al modular la sobreproducción de células B.

La red de citoquinas desempeña un papel importante en el desarrollo del LES. En algunos experimentos in vitro, la melatonina podría inhibir los efectos inmunitarios de algunas citocinas y linfocitos T. Así que observamos los efectos de la melatonina en la perturbación de la red de citocinas. Se cree que la IL-6 es una citocina inflamatoria secretada por una variedad de células tisulares, incluidos los macrófagos y las células Th2. El nivel de IL-6 tiene correlación positiva con el índice de actividad del LES. Nuestros resultados mostraron que el nivel de IL-6 aumentó después de la inyección de pristano, mientras que la melatonina podría disminuir la producción de IL-6. El aumento del nivel de IL-6 podría hacer que las células B secretaran más anticuerpos y promovieran el desarrollo de nefritis . Por lo tanto, la regulación a la baja de la producción de IL-6 por la melatonina es útil para inhibir la producción de anticuerpos y las lesiones renales.

La IL-2 es secretada por las células Th1, y la IL-13 es secretada por las células Th2. Hay algunos resultados contradictorios en los documentos sobre los cambios de IL – 2 e IL-13. En este modelo de LES inducido por pristano, investigamos los niveles de las dos citocinas. Nuestros resultados revelaron que el nivel de IL-2 en los ratones inyectados con pristano era inferior al de los ratones normales, mientras que el nivel de IL-13 en los ratones inyectados con pristano era superior al de los ratones normales. También encontramos que la melatonina podría disminuir la producción de IL-13 pero aumentar la producción de IL-2. Muchos informes mostraron que el nivel de IL-2 disminuyó en el LES, especialmente en la etapa activa, y que la IL-2 podría disminuir la activación de los linfocitos B. Algunas investigaciones mostraron que la melatonina podría regular el nivel de receptores de IL-2/IL-2 , que puede ser el mecanismo de la acción inhibidora de la melatonina en la producción de IL-2. Se creía que la IL-13, una de las citoquinas más importantes en el lupus, era un factor activador de células B que resultó en la producción excesiva de muchos autoanticuerpos . La IL-13 tiene relación con las lesiones renales del LES . Por lo tanto, la regulación a la baja de la producción de IL-13 por la melatonina también es útil para inhibir la producción de anticuerpos y las lesiones renales.

El nivel decreciente de citoquina de tipo Th1 y los niveles crecientes de citoquina de tipo Th2 también indicaron que hubo un cambio de Th1 a Th2 en el lupus inducido prístino. Algunos informes mostraron que la melatonina exógena podría activar las células T y promover significativamente las citocinas de tipo Th1, que participan en la regulación de las alteraciones inmunitarias . Nuestros resultados mostraron que la melatonina podía regular al alza las citocinas de tipo Th1 y regular a la baja las citocinas de tipo Th2. Y eso indicó que la melatonina podría modular la perturbación de la red de citoquinas en los ratones LES al regular el desequilibrio de Th1/Th2.

La prednisona , que es un fármaco común para el LES, se utilizó como fármaco positivo en este estudio. Encontramos que la prednisona tenía un efecto regulador sobre el LES inducido por pristano. En comparación con la prednisona, la melatonina tuvo un efecto similar o un poco anterior en los síntomas del LES. Como hemos sabido, las reacciones adversas de la prednisona son más comunes y graves que las de la melatonina. Por lo tanto, pensamos que la melatonina podría ser un fármaco potencial para el LES.

En conclusión, el lupus inducido por pristano muestra alteraciones en el sistema inmunitario, como niveles elevados de autoanticuerpos y desequilibrio de la red de citoquinas, lo que induce la nefritis seguida. Los cambios son similares al lupus humano, y pristane es común en el medio ambiente; por lo tanto, este modelo es apropiado para estudiar los efectos de la melatonina en el LES relacionado con el medio ambiente. Por otro lado, también demostramos que la administración de melatonina inhibía los cambios en el lupus inducido por pristano. Y eso sugirió que la melatonina tenía un efecto beneficioso en el lupus relacionado con el medio ambiente. Los mecanismos podrían implicar su modulación de alteraciones en el sistema inmunitario, especialmente en la red de citocinas. Sin embargo, deberían ser necesarios más estudios para comprender mejor el proceso regulador y el factor clave de su acción sobre las enfermedades autoinmunes.