hiivakaksihybridijärjestelmän (Y2H) kehitys ja asteittaiset parannukset 90-luvun alusta lähtien mullistivat proteiinien vuorovaikutusten havaitsemisen1.
Hiivakaksihybridi perustuu funktionaalisen transkriptiotekijän (TF) ennallistamiseen kahden kiinnostavan proteiinin tai polypeptidin vuorovaikutuksessa. Tämä tapahtuu geenimuunnelluissa hiivakannoissa, joissa reportaasigeenin transkriptio johtaa tiettyyn fenotyyppiin, yleensä kasvuun selektiivisellä alustalla tai hiivapesäkkeiden värin muuttumiseen. Suosituimmat reporter-geenit ovat HIS3, jolla valitaan hiiva väliaineeseen, josta puuttuu histidiini, ja LacZ, jolla seulotaan hiiva kolorimetrisessä määrityksessä.
Hiivakaksihybridimäärityksen tekniset yksityiskohdat esitetään alla olevassa sarjakuvassa.
kunkin kiinnostavan proteiinin ja TF: n joko DNA: ta sitovan domeenin (DBD) tai aktivoituvan domeenin (AD) välille muodostuu kaksi fuusiota (”hybridit”). DBD: hen fuusioitunutta proteiinia kutsutaan ”syötiksi” ja AD: hen fuusioitunutta proteiinia ”saaliiksi”.
syötin ja saaliseläimen yhteisvaikutuksesta DBD ja AD tuodaan lähelle ja toimiva TF palautuu toimittajageenin yläjuoksulle. Suosituimmissa fuusioissa käytetään hiivan TF Gal4 DBD: tä ja AD: tä. Bakteeriproteiini Lexaa käytetään usein myös DBD: nä yhdessä Gal4 AD: n kanssa.
geenitekniikkana hiivakaksihybridiseula tarjoaa herkän ja kustannustehokkaan keinon testata kahden kohdeproteiinin suoraa vuorovaikutusta tai käyttää suosikkiproteiinia syöttinä halutuista solutyypeistä, kudoksista tai kokonaisista organismeista valmistettujen proteiinifragmenttien kirjastojen seulomiseen. Vuorovaikutuskumppaneiden identiteetti saadaan sitten sekvensoimalla vastaavat plasmidit valituissa hiivapesäkkeissä. Myös täyspitkien proteiinien (”Orfeomien”) kokoelmia on tulossa useille lajeille, mutta ne eivät vielä kata koko proteomia.
hiivakaksihybridijärjestelmä omaksuttiin nopeasti tiedeyhteisössä ja eri lajien ja tutkimusalojen näytöt johtivat jo kymmeniin tuhansiin julkaisuihin. Se on edelleen valintamenetelmä, kun on kyse uudenlaisten proteiinien vuorovaikutusten löytämisestä, mikä näkyy äskettäin julkaistussa kirjallisuudessa.
Y2H: n muunnokset kehitettiin seulontojen suorittamiseksi koekertoimen tai tietyn proteiinikumppaneiden translaation jälkeiseen modifikaatioon tarvittavan entsyymin läsnä ollessa2.
muiden versioiden avulla voidaan seuloa integraalisia kalvoproteiineja3 ja tekniikkaa on mukautettu havaitsemaan proteiinien ja proteiinien yhteisvaikutuksia nisäkässoluissa4. Lopulta kehitettiin myös hiivan n-hybridiprotokollia uusien DNA-protein5 -, RNA-protein6-ja pienimolekyyli-proteiini-interaktioiden seulomiseksi.7.
Discover Hybrigenics uusin optimoitu Hiivakaksihybridinäyttöpalvelu: ULTImate Y2H.
ota yhteyttä tutkijatiimeihimme saadaksesi ilmaisia neuvoja projektistasi.
1. Fields, S. and Song, O. a novel genetic system to detect protein-protein interactions (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. ja Arpin, M. Spatial recruitment and activation of the Fes kinase by ezrin promotes HGF-induced cell scattering (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korotensky, C., Johnsson, N. Ja te Heesen, S. A genetic system based on split-ubikitiini for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. and Tavernier, J. Design and application of a cytokine-receptor-based interaction trap (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, J. J. and Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the hiiva origin recognition complex by a one-hybrid system (1993) Science 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. ja Kuhl, D. A tri-hybrid system for the analysis and detection of RNA–protein interactions (1996) Nucleic Acids Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. and Liu, J. O. a three-hybrid system for detecting small ligand-protein
receptor interactions (1996) PNAS 93(23), 12817-12821