5, 3 miRNA-välitteinen kohteiden säätely
RISC: ssä miRNA on vuorovaikutuksessa kohde-geenien kanssa emäsparin kautta. Vuorovaikutus miRNA ja sen kohde mRNA on rajoitettu 5 ’ loppuun miRNA. Nukleotidien 2-8 sekvenssien täydentävyys, joka tunnetaan myös nimellä ”siemenalue”, on tärkeää kohdesekvenssin tunnistamiselle, vaikka poikkeuksia tähän sääntöön on osoitettu . Yleisimmin miRNA-sidontapaikat ovat kohdemerkintöjen 3 ’ – kääntämättömällä alueella (UTR), yleensä useina kappaleina . Mirnan on kuitenkin osoitettu kohdistuvan myös mRNA: n 5 ’ – UTR-ja koodausalueisiin . Tutkimus Tay et al. osoitti, että Mirna-verkko voi Sitoutua useisiin sivustoihin yhden mRNA-kohteen koodauksessa ja 3’ – UTR: ssä, mikä lisää miRNA-välitteisen kohteen sääntelyn monimutkaisuutta . Mirnan siemenalueen ja sitovan kohteen mRNA: n välinen täydentävyysaste määrittää mekanismin, jolla miRNA säätelee kohdetta . Jos miRNA osoittaa riittävän sekvenssin täydentävyyden (lähes täydellisen) kohdemerkittävään mRNA: han, suoritetaan säätely RNA-interferenssiksi kutsutulla prosessilla, jossa RISC ohjataan pilkkomaan kohde-mRNA . Jos täydentävyys ei ole riittävää, kuten yleensä nisäkkäillä, sääntely saavutetaan torjumalla translaatiota ja / tai horjuttamalla mRNA: ta .
RISC: n ydinkomponentit ovat Argonautin (Ago) proteiiniperhe, jolla on keskeinen rooli sen toiminnassa . Kaikki neljä nisäkäs sitten proteiineja (Ago1-Ago4) voi ohjata translationaalinen tukahduttaminen kohde mRNA, kuitenkin vain Ago2 omaa ”slicer” toimintaa, ja on vastuussa pilkkominen kohde mRNA . Kohdegeenien Mirna-välitteisen translationaalisen tukahduttamisen tarkka mekanismi(t) on vielä epävarma . Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että translationaalinen tukahduttaminen tapahtuu ennen kääntämisen aloittamista . Toiset tutkimukset kuitenkin viittaavat siihen, että tukahduttaminen tapahtuu kääntämisen aloittamisen jälkeen . Alun perin ajateltiin, että miRNA-välitteinen kohdegeenien tukahduttaminen heijastuisi pääasiassa proteiinitasolla, eikä se vaikuttaisi lainkaan tai vähäisessä määrin mRNA-tasoihin. Nyt on kuitenkin osoitettu, että miRNA-välitteinen kohdegeenien tukahduttaminen liittyy usein mRNA: n epävakauttamiseen, vaikka ei tiedetä, onko tämä translationaalisen tukahduttamisen toissijainen vaikutus. miRNA-välitteiseen mRNA-kohteiden hajoamiseen liittyy deadenylaatio (Poly A: n pyrstön poisto), jota seuraa katkeaminen ja eksonukleolyyttinen digestio . Lisäksi prosessoivilla kappaleilla (P-rungoilla), mRNA: n varastointiin ja hajoamiseen osallistuvilla sytoplasmarakenteilla, arvellaan olevan myös rooli mirnan säätelyssä . mirnan arvellaan ohjaavan target mRNA: ta ja siihen liittyviä RISC-proteiineja näihin varastorakenteisiin, jotka rikastuvat mRNA: n hajoamis-ja translationaalisiin tukahduttamistekijöihin . Mekanismit, jotka määräävät, seuraako kohde mRNA: ta rappion vai translationaalisen sorron polulla, eivät ole tällä hetkellä tiedossa. Mirna-välitteisen sääntelyn monimutkaisuutta lisäävät viimeaikaiset havainnot siitä, että eri stressiolosuhteissa miRNA-indusoitu kohteiden tukahduttaminen voidaan kääntää ja että miRNA voi aktivoida kohteen mRNA: n kääntämisen .
miRNA-välitteinen säätely vaikuttaa erittäin dynaamiselta prosessilta, sen monimutkaisuutta lisää se, että säätelyssä ei vaadita täydellistä komplimentaarisuutta tavoitteeseen nähden. Tämä osoittaa, että yhdellä mirnalla on mahdollisuus säädellä useita kohdegeenejä. Lisäksi mirnan verkko voi toimia samanaikaisesti säätelemään yhtä mRNA: ta. Tämä lopulta tekee silicossa kohdegeenien tunnistamisen ja miRNA-toiminnan selvittämisen paljon vaikeammaksi.
RISC käyttää siemenaluetta, joka sijaitsee paikoissa 2-7 mirnan 5′ päästä, nukleaatiosignaalina kohteen mRNA tunnistamiseen . MRNA: ssa vastaavista paikoista käytetään nimitystä ”siemenkohteet”. Kohdesiementen tunnistamiseen ja sitomiseen liittyy useita tiukennuksia . Tiukassa siemenkohdassa on täydellinen Watson-Crick-sidos ja se voidaan jakaa neljään ”siemen”-tyyppiin: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 ja 6mer . Kukin näistä tyypeistä eroaa riippuen kannan 1 nukleotidin ja pariutumisen yhdistelmästä asemassa 8. 8mer on sekä adeniini asemassa 1 mRNA kohdealueen ja base-pariksi asemassa 8. Mirna: n paikkaa 1 vastaavan kohteen adeniinin tiedetään lisäävän kohteen tunnistamisen tehokkuutta . 7mer-A1 on adeniini asennossa 1 vain, kun taas 7mer-m8 on base-pariksi asennossa 8 vain. Sen sijaan 6mer ei ole adeniini asemassa 1 eikä base-pariksi asemassa 8 .
tiukan siementen tunnistamisen lisäksi myös kohtalaisen tiukka tunnistaminen on mahdollista, sillä RISC voi sietää pieniä kohtaanto-tai vaappupareja siemenalueella. Wobble–pariliitoksen (kuten G:U) termodynaaminen stabiilisuus on verrattavissa Watson-Crick-pariliitoksen vakauteen .
Watson–Crick-pariutumisen miRNA-molekyylin 3′ – osassa tiedetään parantavan pistetunnistustehoa miRNA-kohteissa, joissa on siementen pariutumista . Parempi nukleotidimäärä otteluissa 3 ’ – osassa eroaa paikasta, jossa on tiukka-siemen-paritus, ja paikasta, jossa on kohtalainen-tiukka-siemen-paritus . Tiukat siemenet vaativat 3-4 ottelua sijoille 13-16, kun taas kohtuulliset-tiukat-siemenet vaativat 4-5 ottelua sijoille 13-19. Sivustoja, joilla on tämä lisäksi 3′ pariliitos kutsutaan 3-täydentävä ja 3’ kompensoiva sivustoja .
on laajasti osoitettu, että valtaosa miRNA-kohdetunnistussekvensseistä löytyy kohdegeenin 3′-UTR: stä, vaikka miRNA-ladattu RISC voi teoriassa sitoa minkä tahansa mRNA: n segmentin. Kohdegeeneillä on yleensä pidempi 3 ’UTR, kun taas tietyillä ubiquitous-geeneillä, kuten house-keeping-geeneillä, on yleensä lyhyt 3′ UTR, mikä mahdollisesti estää mirnan säätelemästä niitä . Maalipaikat eivät jakaudu tasaisesti 3′ UTR: llä. Ne sijaitsevat lähellä molempia päitä pitkällä 3’ UTR: llä (yleensä ≥2000 nt). Lyhyemmillä 3 ’ UTR: llä maalipaikat ovat yleensä ~15-20 nt: n päässä pysäytyskodonista .
vaikka yleisesti katsotaan, että funktionaaliset miRNA-alueet sijaitsevat mieluiten 3′ UTR-alueella, myös koodausjärjestyksen ja 5′ UTR-alueiden siemenalueet voivat edistää mRNA: n alasäätelyä . Suosituimmuuskohtelun miRNA-sitomiselle 3′ UTR: ssä voi olla useita selityksiä. Esimerkiksi RISC voi joutua kilpailemaan muiden proteiinikompleksien, kuten ribosomien kanssa, jotka sitoutuvat koodausjärjestykseen ja translaation initiaatiokomplekseihin 5′ UTR: ssä. Näin ollen 3 ’ UTR saattaa yksinkertaisesti olla helpommin saavutettavissa pitkän aikavälin sidontaan kuin kaksi muuta sivustoa .