az élesztő két hibrid rendszerének (Y2H) fejlődése és fokozatos fejlesztése a 90-es évek eleje óta forradalmasította a fehérje kölcsönhatások kimutatásának módját1.
az élesztő két hibrid alapja egy funkcionális transzkripciós faktor (TF) feloldása, amikor két érdekes fehérje vagy polipeptid kölcsönhatásba lép. Ez géntechnológiával módosított élesztőtörzsekben történik, amelyekben egy riporter gén transzkripciója specifikus fenotípushoz vezet, általában szelektív táptalajon történő növekedéshez vagy az élesztőtelepek színének megváltozásához. A legnépszerűbb riportergének a HIS3 az élesztő kiválasztására hisztidin nélküli táptalajon, a LacZ pedig az élesztő szűrésére kolorimetriás vizsgálatban.
az élesztő két hibrid vizsgálat technikai részleteit az alábbi rajzfilm vázolja fel.
két fúzió (‘hibridek’) jön létre az egyes érdekes fehérjék és a TF DNS-kötő doménje (DBD) vagy aktiváló doménje (AD) között. A DBD-hez fuzionált fehérjét csalinak, az AD-hez fuzionált fehérjét pedig zsákmánynak nevezik.
a csali és a zsákmány közötti kölcsönhatást követően a DBD és az AD közvetlen közelségbe kerül, és a riporter gén előtt funkcionális TF keletkezik. A legnépszerűbb fúziók a TF gal4 élesztő DBD-jét és AD-jét használják. A Lexa baktériumfehérjét gyakran használják DBD-ként is Gal4 AD-vel kombinálva.
genetikai technikaként az élesztő két hibrid képernyő érzékeny és költséghatékony eszközt kínál két célzott fehérje közvetlen kölcsönhatásának tesztelésére, vagy a kedvenc fehérje csaliként történő felhasználására a kívánt sejttípusokból, szövetekből vagy teljes organizmusokból előállított fehérjefragmensek könyvtárainak szűrésére. A kölcsönható partnerek azonosságát ezután a megfelelő plazmidok szekvenálásával kapjuk meg a kiválasztott élesztőtelepekben. A teljes hosszúságú fehérjék (‘ORFeomes’) gyűjteményei több faj számára is elérhetővé válnak, de még nem fedik le a teljes proteomot.
az élesztő két hibrid rendszert a tudományos közösség gyorsan elfogadta, és a különböző fajok és kutatási területek képernyői már több tucat ezer publikációhoz vezettek. Ez továbbra is a választott módszer, amikor új fehérje kölcsönhatásokat fedeznek fel, amint azt a nemrégiben megjelent irodalom is tükrözi.
az Y2H variációit úgy fejlesztették ki, hogy képernyőket vezessenek be egy KO-faktor jelenlétében, vagy a fehérje partnerek adott poszttranszlációs módosításához szükséges enzim2.
más változatok lehetővé teszik az integrált membránfehérjék szűrését3, és a technikát adaptálták a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására emlős sejtekben4. Végül élesztő n-hibrid protokollokat is kidolgoztak az új DNS-protein5, RNS-protein6 és kis molekula-fehérje kölcsönhatások szűrésére7.
fedezze fel a Hybrigenics legújabb optimalizált élesztő két hibrid képernyő szolgáltatást: ULTImate Y2H.
vegye fel a kapcsolatot tudóscsoportjainkkal ingyenes tanácsokért a projektjével kapcsolatban.
1. Fields, S. és Song, O. egy új genetikai rendszer a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására (1989) Természet 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. és Arpin, M. a Fes kináz térbeli toborzása és aktiválása ezrin által elősegíti a HGF által kiváltott sejtszórást (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korosztenszkij, C., Johnsson, N. és te Heesen, S. Split-ubiquitin alapú genetikai rendszer a membránfehérjék közötti kölcsönhatások elemzésére in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman , S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. és Tavernier, J. citokin-receptor alapú interakciós csapda tervezése és alkalmazása (2001) Nat sejt Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, J. J. és Herskowitz, I. Az orc6 izolálása, az élesztő eredetfelismerő komplex egyik összetevője egy hibrid rendszerrel (1993) tudomány 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. és Kuhl, D. Tri-hibrid rendszer az RNS-fehérje kölcsönhatások elemzésére és kimutatására (1996) nukleinsavak res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. és Liu, J. O. három hibrid rendszer kis ligandum-fehérje kimutatására
receptor kölcsönhatások (1996) PNAS 93(23), 12817-12821