Il test ELISA produce tre diversi tipi di dati in uscita:
Quantitative
ELISA dati possono essere interpretati in confronto ad una curva standard (una diluizione seriale di un noto, purificato antigene) al fine di calcolare con precisione la concentrazione di antigene in vari campioni (Figura 6).
Qualitativa
ELISAs può anche essere utilizzato per ottenere una risposta sì o no che indica se un particolare antigene è presente in un campione, rispetto a un pozzetto bianco contenente nessun antigene o un antigene di controllo non correlato.
Semi-quantitativo
ELISAs può essere utilizzato per confrontare i livelli relativi di antigene nei campioni di analisi, poiché l’intensità del segnale varierà direttamente con la concentrazione di antigene.
Curva standard
I dati ELISA sono tipicamente graficamente con densità ottica vs concentrazione di log per produrre una curva sigmoidale come mostrato in Figura 6. Le concentrazioni note di antigene vengono utilizzate per produrre una curva standard e quindi questi dati vengono utilizzati per misurare la concentrazione di campioni sconosciuti rispetto alla porzione lineare della curva standard. Questo può essere fatto direttamente sul grafico o con il software di montaggio della curva che si trova in genere sui lettori di piastre ELISA.
Fig. 6. Una tipica curva standard ELISA.
Modelli di curva di calibrazione
Se è necessario un risultato quantitativo, il modo più semplice per procedere è quello di mediare la triplice lettura delle letture standard e dedurre la lettura del campione di controllo in bianco. Quindi, tracciare la curva standard, trovare la linea di migliore adattamento o almeno disegnare una curva punto a punto in modo che la concentrazione dei campioni possa essere determinata. Eventuali diluizioni effettuate devono essere regolate in questa fase. Questa è generalmente la misura pratica in cui il calcolo manuale può essere preso.
Una variante consiste nel tracciare i dati utilizzando semi-log, log/log, log/logit e i suoi derivati – i modelli logistici a 4 o 5 parametri. L’utilizzo di soluzioni basate su software/automatizzate consente di considerare approcci grafici più sofisticati. L’uso della regressione lineare all’interno di un pacchetto software aggiunge molte più possibilità di controllo; è possibile controllare il valore R2 per determinare la bontà complessiva dell’adattamento. Per quella porzione della curva in cui la relazione tra concentrazione e lettura ha una relazione lineare, i valori R2 >0,99 rappresentano una misura molto buona. La precisione può quindi essere ulteriormente migliorata utilizzando ulteriori concentrazioni standard in tale intervallo.
Un aspetto del grafico lineare è che comprime i punti dati sulle concentrazioni più basse della curva standard, rendendo quindi l’intervallo più accurato (area più probabile per raggiungere il valore R2 richiesto). Per contrastare questa compressione è possibile utilizzare un grafico semi-log; qui il log del valore di concentrazione (sull’asse x) viene tracciato contro la lettura (sull’asse y). Questo metodo fornisce una curva dati a forma di S che distribuisce più punti dati nel modello sigmoidale più user friendly.
Il tipo di grafico log/log (log di concentrazione contro log di lettura) riesce a linearizzare maggiormente la curva dei dati. L’intervallo di concentrazione standard da basso a medio è generalmente lineare in questo modello, solo l’estremità più alta dell’intervallo tende a scendere. Il log / logit e i suoi derivati, i modelli logistici a 4 o 5 parametri, sono più sofisticati e richiedono calcoli e stime più complesse di valori max, min, EC50 e slope. Il modello a 5 parametri richiede inoltre il valore di asimmetria.
Mentre questi modelli di curve di calibrazione possono offrire prestazioni migliorate, un buon punto di partenza sarebbe utilizzare il grafico log-log con un controllo sulla percentuale di recupero (recupero dell’analita da campioni a spillo). In alternativa, almeno il “back-fitting” dei valori di lettura della curva standard è spesso un approccio “abbastanza buono”. Il modo più semplice per controllare è calcolare indietro gli standard di calibrazione e verificare che rientrino nel 20% del valore di lettura nominale. Un avvertimento è di non fare affidamento su’ buoni ‘ valori R2 e trovare quel modello di curva di calibrazione che offre i migliori valori di recupero per gli standard.
Sensibilità ELISA
Gli ELISA sono uno dei saggi immunologici più sensibili disponibili. L’intervallo di rilevamento tipico per un ELISA è da 0,1 a 1 fmole o da 0,01 ng a 0,1 ng, con sensibilità dipendente dalle particolari caratteristiche dell’interazione anticorpo-antigene. Inoltre, alcuni substrati come quelli che producono un segnale chemiluminescente o fluorescente potenziato, possono essere utilizzati per migliorare i risultati.
Come accennato in precedenza, il rilevamento indiretto produrrà livelli più elevati di segnale e dovrebbe quindi essere più sensibile. Tuttavia, può anche causare un segnale di fondo più elevato riducendo così i livelli di segnale specifici netti.