Il ruolo delle modificazioni proteiche di T-Bet nella produzione di citochine e differenziazione delle cellule T Helper

Abstract

T-Bet (proteina T-box espressa nelle cellule T, chiamata anche TBX21) è stata originariamente clonata come fattore di trascrizione chiave coinvolto nell’impegno delle cellule T helper (Th) nel lignaggio Th1. T-Bet attiva direttamente la trascrizione del gene IFN e migliora lo sviluppo delle cellule Th1. T-Bet modula simultaneamente IL-2 e Th2 citochine in modo indipendente IFN–, con conseguente attenuazione dello sviluppo delle cellule Th2. Numerosi studi hanno dimostrato che T-bet svolge molteplici ruoli in molti sottotipi di cellule immunitarie, tra cui cellule B, cellule dendritiche, cellule natural killer (NK), cellule T NK e cellule linfoidi innate. Pertanto, T-bet è cruciale per lo sviluppo e il coordinamento delle risposte immunitarie innate e adattive. Per soddisfare questi ruoli multipli, T-bet subisce diverse modifiche proteiche posttranslazionali, come la fosforilazione a tirosina, serina e residui di treonina e l’ubiquitinazione a residui di lisina, che influenzano l’impegno del lignaggio durante la differenziazione cellulare. Questa recensione presenta una panoramica attuale dei progressi compiuti nella comprensione dei ruoli dei vari tipi di modifiche della proteina T-bet nella regolazione della produzione di citochine durante la differenziazione cellulare Th.

1. Introduzione

T-Bet (proteina T-box espressa nelle cellule T, chiamata anche TBX21) è stata descritta per la prima volta nel 2000 in un rapporto che esamina gli effetti di T-bet sulla differenziazione delle cellule T helper 1 (Th1). Negli ultimi 15 anni, molti studi hanno esaminato le funzioni di T-bet e hanno rivelato ruoli multipli per questa proteina durante la differenziazione cellulare, con particolare attenzione ai meccanismi molecolari coinvolti, alle nuove funzioni di questo fattore di trascrizione nelle cellule immunitarie innate e alla modulazione mediata da T-bet delle malattie infiammatorie . È stato chiarito che T-bet svolge un ruolo fondamentale nel coordinamento dell’immunità innata e dell’immunità adattativa e che svolge un’importante funzione nel modulare le malattie infiammatorie croniche, tra cui l’asma e la malattia infiammatoria intestinale, controllando una rete di programmi genetici altamente conservati . Pertanto, la regolazione ottimale dell’espressione e dell’attività di T-bet sembra essere utile per prevenire o trattare l’infiammazione cronica e le malattie autoimmuni.

Sebbene siano stati fatti tentativi per identificare le piccole molecole che controllano l’espressione e l’attività di T-bet che influenzano la risposta immunitaria mediata dalle cellule T, sono stati fatti pochi progressi su questo fino ad oggi. Data l’importanza di T-bet nella regolazione immunitaria, chiarire i meccanismi funzionali alla base dei molteplici ruoli di T-bet faciliterebbe lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici per il trattamento di malattie infiammatorie croniche e autoimmuni. Questa recensione riassume lo stato attuale delle conoscenze sui meccanismi molecolari alla base dei molteplici ruoli interpretati da T-bet nello sviluppo delle cellule Th.

2. Struttura di T-Bet

La T-bet contiene un ammino-terminale, un dominio T-box e un carbossil-terminale, che mostrano rispettivamente l ‘ 82%, il 100% e il 79% di omologia tra topi (530 proteine di residui di amminoacidi) e esseri umani (535 proteine di residui di amminoacidi) (Figura 1). Il dominio T-box, situato tra i residui 135 e 326 nel mouse T-bet, è altamente conservato in 18 membri della famiglia T-box protein (TBX). Le caratteristiche comuni condivise dalle proteine T-box includono una capacità di legame del DNA attraverso il dominio T-box e l’attività di regolamentazione trascrizionale, che svolge un ruolo nel controllo dell’espressione del gene dello sviluppo in tutte le specie animali.

Figura 1

Struttura e modificazione proteica di T-bet. Mouse e umana T-bet è 100% identico nel dominio T-box. Parecchi residui dell’amminoacido sono conservati in topi e subiscono le modifiche posttranslational, compreso fosforilazione ai residui della serina, della treonina e/o della tirosina e ubiquitinazione ai residui della lisina.

Il dominio T-box è costituito da circa 180 residui amminoacidici ed è sia sufficiente che necessario per legarsi alla sequenza di DNA di consenso TCACACCT . Brachyury (T) è stata la prima proteina T-box ad essere identificata e, in forma dimerica, interagisce con le scanalature maggiori e minori del DNA attraverso interazioni idrofobiche e insolito contatto carbonilico della catena principale con una guanina come dimero . TBX1 si lega anche alla sequenza di DNA come dimero, mentre TBX2 sembra legarsi alla stessa sequenza di DNA come monomero . Sebbene TBX1 e TBX2 condividano il 61% di identità nel dominio T-box, la struttura del complesso di legame DNA-T-box sembra essere diversa, a causa della bassa omologia tra le regioni ammino – e carbossile-terminali. Il dominio T-box in T-bet mostra il 50% di omologia con il dominio corrispondente in brachyury (T), TBX1 e TBX2; tuttavia, la struttura cristallina di T-bet legata alla sequenza di DNA rimane da caratterizzare.

3. Regolazione della differenziazione cellulare Th da T-Bet

3.1. Stimolazione della differenziazione cellulare Th1 da parte di T-Bet

T-bet si lega direttamente alla sequenza di DNA di consenso all’interno del promotore IFNG e attiva la sua trascrizione. L’espressione indotta da T-bet di IFNG deriva le cellule precursori Th per differenziarsi in cellule effettrici Th1. Mentre la sovraespressione esogena di T-bet nelle cellule Th naïve aumenta preferenzialmente lo sviluppo delle cellule Th1, la carenza di T-bet porta a una mancata produzione di IFN-γ sufficiente e quindi riduce la generazione di cellule Th1 . L’espressione di T-Bet è notevolmente aumentata dalla stimolazione del recettore delle cellule T (TCR) ed è aumentata dal cotrattamento con IFN-γ e IL-12. IFN-γ si lega al suo recettore e induce l’attivazione del trasduttore di segnale e dell’attivatore della trascrizione (STAT) 1 e della trascrizione del gene T-bet (TBX21). Successivamente, T-bet stimola direttamente la trascrizione di IFNG e IL12RB2. L’espressione del recettore IL-12 (IL-12R) β2 sulla superficie cellulare migliora ulteriormente la produzione di IFN-γ attraverso IL-12 e la via di segnalazione STAT4, con conseguente differenziazione preferenziale delle cellule Th1. È interessante notare che l’espressione T-bet forzata può anche convertire le celle Th2 differenziate in celle Th1 . Pertanto, T-bet è posizionato al punto cruciale dei percorsi regolatori che inducono IFN-γ nelle cellule Th.

3.2. Attenuazione della produzione di IL-2 mediante T-Bet

Oltre alla regolazione IFN-γ, T-bet sopprime significativamente l’espressione. Questa citochina, un fattore di crescita precoce delle cellule T, è essenziale per l’attivazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule Th ed è abbondantemente prodotta sulla stimolazione del TCR. La T-bet introdotta ectopicamente sopprime significativamente la produzione di IL-2 attraverso l’inibizione dell’attività del fattore nucleare kB (NF-kB) p65, in condizioni di differenziazione Th1 e Th2 . Durante la differenziazione delle cellule Th1, la trascrizione IL-2 viene attenuata anche dopo l’induzione di T-bet. L’inibizione di IL-2 mediata da T-bet può influenzare l’espansione delle cellule Th e modulare squisitamente la risposta immunitaria mediata da Th1 dopo l’esposizione a un antigene patogeno.

3.3. Soppressione dello sviluppo delle cellule Th2 da parte di T-Bet

Inoltre, l’introduzione esogena di T-bet nelle cellule Th sopprime la produzione di citochine Th2, come IL-4, IL-5 e IL-13, attraverso la soppressione della proteina-3 legante GATA (GATA-3). Di conseguenza, una mancanza di T-bet induce lo sviluppo spontaneo delle cellule Th2 in vitro e in vivo . L’attività Th2-soppressiva di T-bet è stata confermata anche in assenza di IFN-γ, indicando che T-bet ha una funzione inibitoria discreta, indipendente dalla stimolazione IFN-γ.

3.4. Altre Funzioni di T-Bet

Recentemente, molti studi hanno riportato che il T-bet modula anche altri Th linee cellulari, tra cui Th17, Treg, e follicolare Th (TFH), le cellule, in coordinamento con molti fattori di trascrizione, come l’acido retinoico recettore orfano correlati-yt (RORyt), runt-correlati fattore di trascrizione 3 (RUNX3), e il linfoma a cellule B-6 (BCL6) . Questi risultati suggeriscono che T-bet è un fattore di trascrizione che è fondamentale per la messa a punto dello sviluppo delle cellule Th.

4. Modifica post-traduzione di T-Bet

T-Bet funziona come un giocatore multitasking nella regolazione della differenziazione cellulare. Tuttavia, i meccanismi molecolari che sono alla base dell’attività stimolante e inibitoria di T-bet nella regolazione dell’espressione genica target rimangono da chiarire. Molte proteine multitasking sono note per subire modifiche proteiche post-traduttive e per determinare i destini cellulari esercitando attività inibitoria diretta stimolatoria e indiretta sull’espressione genica target .

4.1. La fosforilazione della tirosina di T-Bet

Il rilevamento anticorpale delle proteine T-bet nei western blot si traduce in bande multiple, suggerendo la modifica post-traduttiva di T-bet nelle cellule Th innescate dal TCR. La fosforilazione della tirosina della proteina T-bet si verifica principalmente durante le fasi iniziali (giorni da 2 a 3) dello sviluppo delle cellule Th, dopo l’impegno del TCR, e declina in seguito. Il trattamento delle cellule Th con l’inibitore della tirosina fosfatasi pervanadato aumenta la fosforilazione della tirosina di T-bet. La T-Bet è localizzata principalmente nel nucleo e la tirosina chinasi nucleare IL2-inducibile tirosina chinasi (ITK) è stata identificata come la tirosina chinasi a monte responsabile. La carenza di ITK impedisce la fosforilazione della tirosina di T-bet nelle cellule Th dopo la stimolazione con TCR e IL-12. La ricerca mutazionale ha rivelato che il residuo di tirosina 525 (Y525) è il sito di fosforilazione pertinente e che la fosforilazione in questo sito svolge un ruolo importante nell’interazione con GATA-3. Sebbene il dominio T-box in T-bet sia importante per il DNA e l’interazione proteina-proteina, la fosforilazione della tirosina di Y525 è prerequisito per la soppressione della differenziazione cellulare Th2 mediata da GATA-3. Il blocco della fosforilazione Y525 abroga l’interazione con e la soppressione di GATA-3, con conseguente compromissione della soppressione di Th2 .

Inoltre, un’altra tirosina chinasi nucleare, c-Abl, induce la fosforilazione di T-bet ai residui di tirosina 219, 265 e 304 nel topo T-bet . Una carenza di c-Abl così come la mutazione di T-bet a questi residui (mutanti Y219/265/304F) porta ad un fallimento per aumentare l’induzione IFN-γ e per sopprimere la produzione di citochine Th2, a causa della perdita di fosforilazione a questi residui di tirosina. Questo, a sua volta, provoca l’aggravamento dell’infiammazione polmonare allergica in vivo . Questi risultati suggeriscono che la fosforilazione della tirosina indotta da ITK e c – Abl di T-bet è essenziale per la modulazione dello sviluppo delle cellule Th2 e la risposta immunitaria allergica.

4.2. Fosforilazione serina di T-Bet

Sebbene la soppressione mediata da T-bet dello sviluppo delle cellule Th2 sia compromessa dalla mutazione di Y525 e dall’assenza di chinasi c-Abl, la soppressione di IL-2 viene mantenuta con una T-bet mutante Y525, suggerendo l’esistenza di un ulteriore meccanismo di regolazione per la modulazione IL-2 . È interessante notare che l’aspetto di più bande di proteine T-bet su western blot potrebbe essere eliminato con l’aggiunta di fosfatasi intestinale di vitello, che elimina prevalentemente la fosforilazione a residui di serina/treonina. L’analisi spettrometrica di massa ha poi rivelato la serina 508 (S508) come un altro sito di fosforilazione in T-bet. La mutazione di S508 abolisce la fosforilazione mediata da caseina chinasi- (CK-) e glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK-3-) in T-bet, così come l’attività IL-2–soppressiva della proteina. Inoltre, la fosforilazione S508 è importante per l’interazione di T-bet con NF-kB p65 e per la prevenzione del legame di NF-kB p65 al promotore IL2. In accordo con la funzione di T-bet come inibitore NF-kB p65, le cellule T-bet-null Th1 sostengono l’attività NF-kB p65 durante la differenziazione delle cellule Th1 e quindi producono più IL-2. Pertanto, è stato suggerito che T-bet sia un inibitore fisiologico di IL-2 durante la differenziazione cellulare Th1, attraverso la soppressione dipendente dalla fosforilazione S508 di NF-kB p65.

4.3. Treonina fosforilazione di T-Bet

Molto recentemente, treonina 302 (T302) è stato caratterizzato come un nuovo sito di fosforilazione in T-bet , anche se non è chiaro quale chinasi e fosfatasi influenzano la fosforilazione di questo residuo. Tuttavia, il ripristino delle cellule T-bet-null Th con una T-bet T302-mutante ha stimolato la produzione di IFN-γ tanto quanto ha fatto wild-type T-bet; tuttavia, il mutante non è riuscito a sopprimere IL-2 e altre citochine Th2. Ulteriori analisi hanno dimostrato che la fosforilazione T302 è necessaria per l’interazione di T-bet con il fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) e per la downregolazione delle citochine IL-2 e Th2 mediate da NFAT, come IL-4, IL-5 e IL-13. NFAT non è cruciale per l’induzione della produzione IFN-γ e T302-mutant T-bet è in grado di legarsi al promotore IFNG; quindi, la produzione IFN-γ era paragonabile tra wild-type e mutant T-bet. In altre parole, la mutazione di T302 ha abrogato la soppressione mediata da T-bet della produzione di citochine IL-2 e Th2, ma non ha influenzato l’attività di legame al DNA e IFN-γ-stimolante di T-bet.

Infatti, T302 si trova nella T-box legante il DNA, così come Y304 . Il dominio T-box è costituito da diverse ripetizioni di filamenti β e α-eliche ed è coinvolto sia nella dimerizzazione che nel legame del DNA . Muller e Herrmann hanno predetto che le α-eliche aH3 e aH4 in brachyury (T) sono importanti per l’interazione diretta di questa proteina con le scanalature minori e maggiori del DNA . Tuttavia, T302 non può essere associato direttamente con le scanalature del DNA, indipendentemente dal suo stato di fosforilazione. Sarebbe interessante sapere quale chinasi e fosfatasi a monte regola la fosforilazione T302 e se la fosforilazione T302 influisce su altre modificazioni proteiche di T-bet.

4.4. L’ubiquitinazione della lisina 313 in T-Bet

L’espressione di T-bet è fondamentale per la regolazione trascrizionale di IFNG e per lo sviluppo delle cellule Th1, ma i mezzi di regolazione di T-bet a livello proteico devono ancora essere identificati. Jang et al. recentemente hanno riferito che T-bet subisce degradazione proteasomica ubiquitinazione-mediata durante le fasi successive della differenziazione cellulare Th1 . Dei 16 residui di lisina presenti nella proteina T-bet del topo, 11 si trovano prevalentemente all’interno del dominio T-box e i restanti 5 si trovano al carbossil-terminale (residui da 326 a 530), mentre nessun residuo di lisina è presente nell’ammino-terminale (residui da 1 a 134). È interessante notare che i residui di lisina all’interno del dominio T-box sono preferenzialmente ubiquitinati su sovraespressione di ubiquitina. Ulteriori analisi hanno identificato che la mutazione della lisina 313 (K313) diminuisce la degradazione della T-bet mediata dall’ubiquitinazione e migliora il livello di espressione della T-bet nel nucleo e nel citoplasma. Nonostante l’aumento dei livelli del mutante K313, questa mutazione ha completamente abrogato le funzioni di T-bet che coinvolgono il legame del DNA, l’attivazione trascrizionale di IFNG e la soppressione della produzione di citochine IL-2 e Th2. La struttura cristallina delle α-eliche del dominio T-box legato al DNA suggerisce fortemente che il gruppo amminico di K313 è associato al fosfato di una base del DNA attraverso l’interazione idrogeno-legame. Inoltre, la mutazione di K313 egualmente conduce all’incapacità di sopprimere la produzione di citochine IL-2 e Th2; tuttavia, l’interazione con e la soppressione di GATA-3 e di NF-kB p65 non sono alterate dalla mutazione di K313. È interessante notare che l’interazione NFAT è abolita in K313-mutante T-bet, che è anche fortemente associato ad un’assenza di fosforilazione a T302. Non è ancora chiaro se e come K313 regola la fosforilazione T302 e viceversa.

5. T-Bet nelle malattie infiammatorie e autoimmuni

Da Mosann et al. scoperti sottoinsiemi Th1 e Th2 che producono citochine firma, IFN-γ, e IL-4, IL-5, e IL-13 , rispettivamente, e che modulano le risposte immunitarie infiammatorie e allergiche, ulteriori studi hanno identificato nuovi sottoinsiemi di cellule Th, come le cellule Th17, TFH e Treg . Studi approfonditi hanno anche caratterizzato le vie di segnalazione delle citochine e i fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione delle risposte immunitarie ai patogeni . È importante sottolineare che T-bet svolge un ruolo fondamentale nel controllo della differenziazione di diversi sottoinsiemi di cellule Th e nella modulazione delle malattie infiammatorie e autoimmuni .

T-Bet funziona anche come regolatore antiasmatico. Una carenza di T-bet porta spontaneamente allo sviluppo di sintomi asmatici, che è caratterizzata da una maggiore infiltrazione di eosinofili nelle vie aeree, iperplasia delle cellule caliciformi che secernono muco e rimodellamento cronico delle vie aeree con accumulo di collagene e miofibroblasti proliferativi; queste caratteristiche sono spesso osservate anche nei pazienti asmatici . Il ripristino dell’espressione di T-bet sposta l’equilibrio immunitario a una risposta Th1 e previene e attenua l’infiammazione polmonare patologica in vivo .

Inoltre, T-bet è protetto contro le infezioni patogene intracellulari. L’abrogazione della produzione di IFN-γ indotta da T-bet ha determinato una maggiore suscettibilità ai patogeni intracellulari in vivo, tra cui Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major e Salmonella typhimurium , sottolineando l’importanza della produzione di IFN-γ da parte delle cellule Th1 che esprimono T-bet nella difesa contro le infezioni batteriche. Tuttavia, i topi T-bet-carenti sono resistenti all’infezione da Listeria monocytogenes, perché la produzione di INF-γ da parte delle cellule natural killer è sia necessaria che sufficiente per la difesa dell’ospite contro L. monocytogenes .

Inoltre, T-bet può aggravare lo sviluppo di malattie infiammatorie e autoimmuni, tra cui malattie infiammatorie intestinali, encefalomielite autoimmune sperimentale, artrite infiammatoria e diabete di tipo I, poiché queste malattie infiammatorie sono attenuate in assenza di T-bet . Questi risultati suggeriscono che la messa a punto della risposta immunitaria mediante modulazione dell’espressione T-bet potrebbe avere effetti benefici per i pazienti con asma cronico, malattia infiammatoria intestinale, artrite, sclerosi multipla e diabete.

6. Conclusioni e prospettive

T-bet è un fattore di trascrizione contenente il dominio T-box che è tipicamente coinvolto nella regolazione dello sviluppo ma esercita molteplici funzioni nella differenziazione cellulare Th; attivazione trascrizionale delle cellule Th1 che esprimono IFN-γ, soppressione indiretta dello sviluppo delle cellule Th2, Th17 e Treg e modulazione fine della produzione di IL-2 nelle cellule Th1. Questo multitasking non è sorprendente, poiché T-bet subisce diverse modifiche post-traduzione. La fosforilazione a Y525 svolge un ruolo nella soppressione di GATA-3 durante la regolazione Th2, la fosforilazione a S508 provoca la soppressione di NF-kB p65 nel contesto della regolazione IL-2 nelle cellule Th1, la fosforilazione a T302 svolge un ruolo nella messa a punto della produzione di IL-2 e l’ubiquitinazione a K313 Pertanto, la modifica post-traduzione di T-bet facilita la sua diversità funzionale e la complessità della sua modulazione dell’espressione delle citochine (Figura 2). Non è noto se le varie modifiche posttranslazionali si verificano sequenzialmente o simultaneamente, se un tipo di modificazione proteica influisce su altre modificazioni o se i cambiamenti nella modificazione posttranslazionale di T-bet sono correlati allo sviluppo di malattie infiammatorie infettive e croniche. Un’ulteriore identificazione di nuove modificazioni proteiche relative alle funzioni di T-bet fornirebbe preziose informazioni sullo sviluppo di potenti interventi terapeutici per il controllo delle malattie infiammatorie croniche e autoimmuni.

Figura 2

Molteplici funzioni T-bet giocano un ruolo nella differenziazione cellulare Th. L’induzione dell’espressione di T-bet attraverso l’attivazione di STAT1 e STAT4 stimola direttamente la trascrizione di geni contenenti elementi di legame T-box, come IFNG, IL12RB2 e CXCR3, migliorando così lo sviluppo delle cellule Th1. T-Bet subisce la fosforilazione della serina a S508 e poi downregulates la produzione IL-2 in cellule Th1 reclutando NF-kB p65 dal promotore IL2. I livelli proteici di T-bet nelle cellule Th1 possono essere controllati dalla via di degradazione proteasomica mediata dall’ubiquitina. Inoltre, la proteina T-bet subisce ulteriori modifiche post-traduttive, ad esempio la fosforilazione a T302 e Y525, che facilita la sua soppressione della produzione di citochine Th2 indotta dall’attivazione di NFAT e GATA-3.

Elenco delle Abbreviazioni

Conflitto di interessi

Non è stato rivelato alcun potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimento

Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca di metà carriera attraverso NRF Grant (2013R1A2A2A01068302).