La struttura cristallina di un tetraidrofolato-bound diidrofolato reduttasi rivela l’origine del lento rilascio del prodotto

Isolamento da cristallizzazione di endogeno (6s)-5,6,7,8-tetraidrofolato-bound E. coli DHFR complesso

La struttura della eDHFR:FH4 complesso binario è stato determinato dalla sostituzione molecolare utilizzando il eDHFR:Folati:NADP+ chiuso complesso ternario (PDB ID: 7DFR)50. Come mostrato in Fig. 2, la chiara densità elettronica conferma il ligando endogeno co-purificato come FH4 basato sulla geometria tetraedrica di sp3 C6 coerente con uno stereoisomero 6s. Ciò è in contrasto con la geometria planare trigonale di sp2 C6 in un complesso binario FH2 ottenuto da condizioni di cristallizzazione simili.

Confronto delle strutture ligand di eDHFR:FH4 (verde, figura superiore) e eDHFR: FH2 (arancione, figura inferiore) complessi. Le mappe Fo-Fc omettono densità elettronica sagomate attorno ai ligandi sono mostrate a livello 3.0 σ. Le viste a destra vengono ruotate di 90° in senso antiorario attorno all’asse verticale dalle prospettive mostrate a sinistra. FH4 e FH2 sono mostrati come bastoncini. L’atomo di carbonio C6 è colorato in magenta e i suoi diversi stati di ibridazione in FH4 e FH2 sono indicati da frecce di puntamento magenta. Tutti gli altri atomi sono colorati come segue: ossigeno in rosso, azoto in blu, carbonio in verde e arancione per FH4 e FH2, rispettivamente. Solo gli atomi non idrogeno sono mostrati per semplicità di visualizzazione

Nel tentativo di capire perché otteniamo il complesso FH4, mentre altri hanno fallito, abbiamo identificato che l’origine dei due diversi complessi di ligandi (FH4 vs. FH2) è la tempistica della raccolta dei cristalli e quindi la durata della crescita dei cristalli. Uno studio del corso di tempo mostrato in Fig. 3 che segue le variazioni di densità di elettroni del legante legato a diversi giorni di crescita del cristallo ha rivelato che il decadimento da FH4 a FH2 (riflesso nella transizione da sp3 a sp2 in posizione C6) si è verificato circa 2-3 giorni dopo la cristallizzazione impostata.

Le viste stereo del corso temporale di Fo–Fc omettono i cambiamenti della mappa della densità elettronica corrispondenti alla conversione di FH4 in FH2. Le mappe Fo-Fc omettono densità elettronica sagomate attorno ai ligandi sono mostrate a livello 3.0 σ. L’eDHFR:I cristalli complessi binari FH4 sono stati coltivati al buio a temperatura ambiente. Ad ogni punto di tempo, un singolo cristallo da una goccia di cristallo indipendente è stato raccolto mediante congelamento lampo per la diffrazione dei raggi X. Le strutture di ligando di FH4 e FH2 di strutture complesse binarie completamente raffinate a 2 e 14 giorni, rispettivamente, sono mostrate in ogni figura come riferimenti da confrontare con il cambiamento delle densità di elettroni. Le mappe di omissione per i cristalli raccolti a 3 e 6 giorni sono state generate dopo l’affinamento strutturale iniziale senza introdurre leganti o solventi. La sovrapposizione delle strutture proteiche è stata eseguita utilizzando PyMOL69

Questa è la prima volta a nostra conoscenza che un autentico complesso DHFR a dominio singolo associato a FH4 è stato isolato. Abbiamo convalidato il protocollo per riprodurre la cristallizzazione del complesso eDHFR:FH4 e confermato il decorso temporale del decadimento da FH4 a FH2 con almeno due repliche indipendenti ad ogni punto temporale di raccolta del cristallo (Fig. 1). Le densità di elettroni intermedi lungo il corso temporale del decadimento del ligando mostrano chiaramente la transizione da sp3 a sp2 nella posizione C6 e la rotazione concomitante dell’anello benzoile del ligando legato (Fig. 3). Ciò può assomigliare alla conformazione del legante dello stato di transizione nella direzione catalitica in avanti. Il decadimento osservato da FH4 a FH2 durante la crescita dei cristalli probabilmente non riflette la catalisi inversa da DHFR che comporta la conversione di FH4 in FH2. Probabilmente non è indotto dalla luce, considerando che le gocce di cristallizzazione sono state incubate a temperatura ambiente al buio durante la crescita dei cristalli, e il corso temporale del decadimento da FH4 a FH2 è dell’ordine dei giorni. Abbiamo anche testato la co-cristallizzazione con gli agenti riducenti ditiotreitolo(DTT) o Tris (2-carbossietil)fosfina (TCEP) a concentrazione di 2-3 mm e l’introduzione di DTT o TCEP per un massimo di 20 min di ammollo di cristallo prima della raccolta a 2 giorni, 3 giorni, 14 giorni fino a 7,5 mesi. Ancora una volta, queste procedure non hanno influenzato la riproducibilità dei cambiamenti di densità elettronica del ligando qualitativamente lungo il corso del tempo di decadimento del complesso eDHFR: FH4 nella forma cristallina identificata in questo studio(Fig. 1). Pertanto, è probabile che l’attuale protocollo di cristallizzazione cristallizzi preferenzialmente il complesso endogeno FH4 co-purificato nei campioni di proteine eDHFR, e il suo decadimento nel cristallo è irreversibile nelle condizioni che abbiamo testato, probabilmente a causa dell’ossidazione a un livello finito di ossigeno. Sebbene la rapida reazione catalitica diretta di produrre FH4 da FH2 sia favorita termodinamicamente in presenza di quantità eccessive di NADPH come in vivo, il lento decadimento del complesso FH4 in un complesso FH2 può verificarsi senza una continua fornitura di NADPH come abbiamo osservato qui sotto la condizione di cristallizzazione in vitro. Quindi, il mistero del perché il complesso FH4 a lungo perseguito fosse difficile da ottenere si rivela essere la sua intrinseca instabilità. È molto probabile che la chiave del nostro successo di ottenere la struttura complessa FH4 chimicamente labile sia la raccolta tempestiva di cristalli ben diffrattanti entro 2 giorni di crescita sotto la condizione di cristallizzazione qui identificata. Inoltre, un’indagine sul campo DHFR indica che molti cristallografici19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 e NMR12,13,15,17,19,25,26 gli studi di DHFR hanno applicato la dialisi per rimuovere i ligandi endogeni prima di introdurre i ligandi esogeni di interesse. Abbiamo identificato una condizione di cristallizzazione che isola il complesso DHFR endogeno legato a FH4 senza dialisi del campione proteico o introduzione di substrati o prodotti aggiuntivi. Postuliamo che l’attuale condizione di cristallizzazione per il complesso eDHFR:FH4 favorisce la forma legata a FH4 rispetto ad altre forme come il complesso ternario eDHFR:FH2:NADP(H).

Caratterizzazione strutturale del complesso eDHFR:FH4

Il complesso FH4 adotta una conformazione occlusa in eDHFR (vedi Fig. 4 e 5). Ciò è coerente con i risultati precedenti che suggeriscono che tutti i complessi binari e ternari dello stato fondamentale FH4 del ciclo catalitico (trasferimento post idruro e conversione da sp2 a sp3 a C6) si verificano in conformazioni occluse. Ciò è dovuto allo scontro sterico dell’anello pterinico inclinato di FH4 con l’anello nicotinammidico di NADP (H), che si verificherebbe nella conformazione chiusa del ciclo Met20 (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Come indicato in Fig. 4, FH4 ha contatti di van der Waals e interazioni polari favorevoli con residui e acque attive del sito. In particolare, due ponti di sale bidentato con Asp27 e Arg57 ancorano le due estremità di FH4, aminopirimidina (N3 ed esociclico-NH2) e α-carbossilato, rispettivamente, in posizioni quasi identiche come nei complessi substrato/analogici12, 20,24,45.

La struttura del sito attivo del complesso eDHFR:FH4 mostrato nelle viste stereo. a catene laterali (ciano) entro 4 Å di FH4 (verde) e il ciclo Met20 (giallo) sono mostrati come bastoni. Le strutture secondarie sono visualizzate come cartoni animati in grigio e le acque entro 3,5 Å di FH4 come sfere. Le interazioni polari con FH4 sono indicate con linee tratteggiate. La mappa di densità elettronica Fo–Fc che omette FH4 è mostrata a un livello 3.5 σ in rosso e la mappa di omissione 2Fo-Fc a un livello 1.0 σ è mostrata in blu per residui e acque. I tre conformatori dei legami ammidici Ile14-Gli15 sono indicati da un cerchio tratteggiato e da frecce rosse. b Una vista ampliata del collegamento Ile14-Gly15

Sovrapposizione del complesso FH4 con complessi analogici FH2 e FH4. Gli attuali complessi FH4, FH2 e eDHFR riportati e il complesso 5-formil-FH4 riportato insieme alle loro conformazioni occluse del ciclo Met20, i residui Phe31 e i ligandi corrispondenti sono colorati rispettivamente in verde, magenta e giallo. Tutte le altre strutture da ID PDB: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20 e 4PSY (folato:NADP+)20 sono di colore grigio. Il cerchio tratteggiato rosso indica le interazioni π–π proposte tra Phe31 e i gruppi di benzoile ligando che adottano due orientamenti distinti a seconda dei ligandi legati. FH4 e 5-formil-FH4 appartengono a un cluster in contrasto con ddFH4, FH2 e folato, mentre le catene laterali Phe31 rimangono quasi nella stessa posizione in tutte le strutture allineate. I loop Met20 sono classificati in tre stati conformazionali generali, chiusi, parzialmente chiusi e occlusi. Solo chiuso conformazioni può strutturalmente ospitare la nicotinammide gruppo di NADP(H) cofattore entrare nel sito attivo

Ci sono due molecole di acqua, di colmare il Met20 loop e FH4 tramite una rete di legame a idrogeno che coinvolge Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) e Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Queste interazioni sono assenti nei complessi precedentemente riportati (6R)-5,10-dideazatetraidrofolato (ddFH4) 12,45 a causa della sostituzione da N a C nelle posizioni 5 e 10 nell’analogo. Ciò potrebbe causare la differenza osservata nella conformazione Met20 nell’analogo rispetto al complesso FH4 (Fig. 5). Le uniche strutture disponibili nel PDB che assomigliano molto alla conformazione del ciclo Met20 nel complesso FH4 sono un complesso 5-formil-FH4 (Fig. 5, PDB ID: 1JOM)51 e due complessi inibitori allosterici eDHFR-nanobody che mirano a diversi epitopi DHFR con affinità nanomolare (Fig. 2, PDB IDs: 3K74 e 4EIG)28,29. Il complesso 5-formil-FH4 conserva l’acqua di ponte tra Glu17(NH) e FH4 (N10) come nel complesso FH4, nonostante i loro diversi gruppi spaziali P61 e P212121 rispettivamente. 5-Formil-FH4, noto anche come acido folinico o leucovorin, è un farmaco “rescue” approvato dalla FDA per prevenire gli effetti nocivi del metotrexato durante la chemioterapia53. Il gruppo γ-carbossilico di FH4 mostra poca densità elettronica (Fig. 4), suggerendo disordine o più libertà di rotazione del legame attorno all’asse Cß-Cy o Cy-Cδ C che in altre parti dei ligandi.

Oltre alla rete idrica, abbiamo trovato l’origine strutturale delle interazioni stabilizzanti nel complesso FH4 e il rilascio lento del prodotto sulla base del confronto strutturale degli attuali complessi binari FH4 e FH2 e delle strutture eDHFR precedentemente riportate. In primo luogo, il contatto di van der Waals con la catena laterale Glu17 provoca un’ulteriore schermatura di FH4 dal solvente (Fig. 4) che è assente in substrato o prodotto analogico (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolate complexes12,20,24,45. In secondo luogo, la chiara densità elettronica di tre conformazioni backbone alternative del legame ammidico Ile14-Gli15 conservato suggerisce un contributo entropico alla stabilità del complesso FH4 dalla flessibilità locale all’ancora del loop Met20 (Fig. 4). In particolare, i precedenti studi di mutagenesi hanno dimostrato Ile14 è cruciale per controllare la flessibilità del Met20 loop, mentre I14V, I14A, e I14G varianti tutti hanno mostrato un più lento tasso di trasferimento di idruro, una maggiore flessibilità del Met20 loop come osservato in una conformazione aperta in strutture di cristallo, aumento della dipendenza dalla temperatura del primario effetto isotopico cinetico, e un più alto stato di transizione energia di attivazione calcolato da ibridi QM/MM simulations23,40. In terzo luogo, la rotazione dell’anello del benzoile conduce alle interazioni elettrostaticamente favorevoli del bordo π fronte π-π con il Phe31 conservato nel complesso FH4 contrariamente alle interazioni repulsive del protone-vicino-protone (bordo-a-bordo) nei complessi di FH2, del folato e di ddFH4 indipendentemente dal legame di NADP (H) (Fig. 5, vista espansa, Fig. 6)54,55. L’implicazione funzionale di questo cambiamento strutturale è supportata anche dall’osservazione della concomitante rotazione dell’anello benzoile e della transizione da sp3 a sp2 nella posizione C6 del legante legato durante il corso temporale del decadimento da FH4 a FH2 nel complesso (Fig. 3). Il ruolo di Phe31 nel controllo del rilascio del prodotto è ulteriormente corroborato da precedenti studi di mutagenese56, che hanno dimostrato che le varianti F31V e F31Y di eDHFR hanno mostrato un aumento di due volte della costante di velocità allo stato stazionario kcat e un aumento stimato di 20-50 volte della velocità di rilascio del prodotto oltre all’effetto delle mutazioni sul rallentamento del trasferimento di idruro.

Interazioni elettrostatiche di sistemi π-π. Vedi rif 54,55 per i dettagli

Considerando le proprietà dinamiche del particolare E. coli DHFR sistema, stabile occluso eDHFR:FH4 complesso (a bassa energia libera intermedio dinamico al paesaggio) osservato qui si può ragionevolmente sottendono il lento rilascio del prodotto cinetica (koff tasso di FH4 la dissociazione, il passo di limitazione della velocità di eDHFR ciclo catalitico). Secondo precedenti studi sulla dispersione del rilassamento NMR, ogni fase del ciclo catalitico di E. coli DHFR segue un meccanismo di “selezione della conformazione” piuttosto che di “adattamento indotto” 15. Di conseguenza, la velocità microscopica di ogni passo lungo la coordinata di reazione dipende dalla velocità di campionamento conformazionale dell’enzimo15 (ad esempio, lo stato di transizione competente per il trasferimento rapido di idruro o il rilascio di prodotto limitante la velocità). Ciò implica che più stabile è lo stato fondamentale e più è diverso dal sottostato eccitato, maggiore è il costo energetico gratuito richiesto per campionare tali conformazioni. Per l’eDHFR, ciò comporterà necessariamente la riorganizzazione del sito attivo e del ciclo flessibile Met20. È stato proposto negli studi di dispersione di rilassamento NMR di eDHFR15 che lo stato eccitato sottopopolato per la fase chimica di trasferimento dell’idruro adotta una conformazione occlusa (il cui complesso di Michaelis allo stato fondamentale è in una conformazione chiusa). Tuttavia, lo stato eccitato sottopopolato per la fase di rilascio del prodotto adotta una conformazione chiusa (il cui complesso FH4 dello stato fondamentale è in una conformazione occlusa). Lungo la coordinata di reazione, il complesso binario eDHFR:FH4 attualmente osservato risiede tra i complessi intermedi eDHFR:FH4:NADP+ e eDHFR:FH4: NADPH (Fig. 1). Entrambi adottano conformazioni occluse, in cui la porzione di nicotinammide del cofattore si allontana dal sito attivo15. Per campionare il” sottostato eccitato chiuso ” durante la fase di rilascio del prodotto limitante15, deve verificarsi una riorganizzazione attiva del sito dallo stato fondamentale occluso. Questo è rappresentato dall’intermedio catalitico stabile eDHFR:FH4 catturato in questo studio. Il tasso di dissociazione del prodotto koff di FH4 è stato aumentato al momento del legame del cofattore con un aumento di due volte per eDHFR: FH4: NADP + rispetto a eDHFR:FH4 e un aumento di otto volte per eDHFR:FH4: NADPH rispetto a eDHFR:FH4 misurato sia a pH 6 che a pH 9 mediante esperimenti di competizione35. Ciò indica un rilascio accelerato del prodotto e una maggiore frequenza di campionamento conformazionale quando un cofattore è legato. Sebbene un’autentica struttura dello stato fondamentale del complesso ternario eDHFR:FH4: NADPH non sia mai stata riportata prima, ipotizziamo che ci possa essere un’apprezzabile somiglianza con il complesso binario eDHFR:FH4, poiché tutti gli stati intermedi di terra legati a FH4 adottano una conformazione occlusa15. Ci aspettiamo, tuttavia, che il legame del cofattore aumenti la popolazione dei sottostati eccitati, proposto in precedenza sulla base di studi sulla dispersione del rilassamento NMR per essere in una conformazione chiusa15. Coerentemente con questo, abbiamo osservato che in un complesso ternario della struttura eDHFR:FH2:NADP(H) (determinata anche nel nostro studio in condizioni di cristallizzazione separate), il ciclo Met20 è diventato disordinato. Ciò suggerisce un meccanismo generale di cofattore facilitato scambio ligando migliorando la frequenza di campionamento conformazionale quando il cofattore è legato con la sua porzione nicotinamide che punta lontano dal sito attivo.

Nel complesso FH4, la distanza tra l’anello benzoile FH4 (C1ʹ) e il Phe31 (Cz) è 4,93 Å, che è significativamente più breve di (~0,3–0,6 Å) rispetto alle corrispondenti distanze nell’attuale FH2 e nei complessi FH2 precedentemente riportati (PDB ID: 1RF7, 4PDJ)20,24, che sono rispettivamente 5,22, 5,55 e 5,32 Å. Una tendenza simile di accorciamento della distanza lungo la coordinata di reazione di eDHFR è stata enfatizzata in due studi computazionali indipendenti. Uno studio QM/MM ha calcolato che la distanza corrispondente viene ridotta di ~0,3 Å dal complesso di Michaelis allo stato di transizione quando si verifica la reazione di trasferimento dell’idruro e che c’è poca differenza in questa distanza (~0,01 Å) tra lo stato di transizione e il prodotto di reazione27. Un altro studio che utilizza la dinamica molecolare quantistica/classica mista ha suggerito un accorciamento più drammatico della distanza corrispondente di ~1 Å mentre la reazione si evolve dal reagente allo stato di transizione18. Pertanto, le nostre osservazioni cristallografiche sono in generale d’accordo con la precedente modellazione computazionale suggerendo che, in una certa misura, il complesso FH4 preserva la natura fisica dello stato di transizione. Ciò è anche coerente con le precedenti osservazioni sul paesaggio energetico dinamico di eDHFR mappato dalla dispersione di rilassamento NMR che ogni intermedio nel ciclo catalitico campiona stati eccitati a bassa quota le cui conformazioni assomigliano a strutture dello stato fondamentale degli intermedi precedenti o seguenti15. Poiché gli enzimi stabilizzano lo stato di transizione, il rilascio lento del prodotto della famiglia DHFR potrebbe essere attribuibile al riporto della natura fisica dello stato di transizione al complesso del prodotto di reazione. Questo è suggerito dal complesso FH4 a lungo perseguito qui determinato, oltre ai cambiamenti conformazionali specie-specifici richiesti durante il ciclo catalitico32.

Caratterizzazione di un complesso occluso di eDHFR con un inibitore a lenta insorgenza di affinità di legame nanomolare

La cristallografia a raggi X mostra che il complesso di eDHFR con un inibitore stretto a lenta insorgenza AMPQD46 mostra anche la conformazione occlusa. Il ciclo Met20 ha adottato una conformazione nel complesso AMPQD che assomiglia a quella del complesso ternario con una fenformina anti-diabetica biguanide e NADP + (PDB ID: 5UIH) 52. D’altra parte, l’agente chemioterapico approvato dalla FDA metotrexato è stato precedentemente dimostrato dalla cristallografia a raggi x24, 47, NMR48 e cinetica a singola molecola 49 per legarsi nella conformazione DHFR chiusa (Fig. 7). Questa discrepanza nelle conformazioni proteiche era inaspettata poiché tutti e tre gli inibitori condividono una caratteristica strutturale comune: il gruppo biguanidico della fenformina, il gruppo diaminopirimidinico dell’AMPQD e il gruppo diaminopterinico del metotrexato, ciascuno collegato a un gruppo fenilico con un linker flessibile. Tuttavia, un attento esame dalla sovrapposizione strutturale dei corrispondenti complessi eDHFR-inibitore (Fig. 7) ha mostrato che il gruppo di legame metilammino del metotrexato (assente in fenformina e AMPQD) occupava una posizione che si tradurrebbe in un potenziale scontro sterico con il ciclo Met20 se adottasse una conformazione occlusa come nei complessi fenformina e AMPQD. In precedenza abbiamo dimostrato che AMPQD ha mostrato una preferenza relativamente più alta (una diminuzione di tre volte in IC-50 e Ki) per l’inibizione dell’eDHFR rispetto al DHFR46 umano. Una specie-specificità ancora più elevata per E. coli sopra DHFR umano (~30 volte) è osservato per il composto genitore di AMPQD, che manca il gruppo di coda aminofenile e il linker metilene46. L’attuale struttura cristallina del complesso occluso di eDHFR con AMPQD fornisce una spiegazione meccanicistica plausibile per la sua specie-specificità, attribuibile alle differenze negli equilibri conformazionali di DHFR umano vs. eDHFR. Il primo è osservato esclusivamente in conformazioni chiuse, mentre il secondo mostra una maggiore flessibilità conformazionale campionando in conformazioni chiuse e occluse, come discusso di seguito.

Struttura dell’eDHFR: complesso inibitorio AMPQD. una vista stereo delle interazioni del sito attivo con AMPQD con la mappa omissione Fo-Fc a un livello 3.5 σ. Le catene laterali proteiche (ciano) entro 4 Å da AMPQD (verde) sono mostrate come bastoncini, inclusi due residui del ciclo Met20 (giallo). Le interazioni polari sono indicate con linee tratteggiate. b Sovrapposizione di AMPQD (verde), fenformina (giallo, PDB: 5UIH)52 e complessi di metotrexato (grigio mostrato come bastoncini sottili da PDB: 1RA3, 1DDS)20,47. I loop Met20 sono mostrati come cartoni animati e ligandi come bastoncini. Le strutture chimiche dei ligandi sono disegnate sopra. NADP (H) non viene visualizzato in nessuna delle strutture per semplicità di visualizzazione

Confronto delle conformazioni DHFR basate sul clustering

Un clustering di strutture DHFR PDB utilizzando l’RMSD degli atomi Ca backbone del ciclo Met20 come metrica della distanza (Fig. 8 e Fig. 3) indica che il DHFR umano adotta esclusivamente una conformazione chiusa (cataliticamente competente per il legame NADPH), mentre l’eDHFR è molto più flessibile con conformazioni chiuse e occluse. Le conformazioni occluse sono meno frequentemente osservate (17%) nelle strutture eDHFR. Sia il complesso di rilascio del prodotto limitante con FH4 che il complesso inibitorio ad esordio lento con AMPQD adottano una conformazione occlusa di eDHFR (Fig. 9) che è raramente rappresentato nel PDB (Fig. 3). È interessante notare che sia FH4 che AMPQD condividono le caratteristiche di affinità nanomolare e rilascio lento da eDHFR35,36,46 con la posizione degli atomi di azoto chiave sugli eterocicli fortemente conservati e le differenze evidenti nelle code. Ciò suggerisce una nuova strategia per sviluppare gli inibitori di DHFR mirando alle conformazioni occluse di eDHFR. Proponiamo anche una strategia per combattere la resistenza ai farmaci. Come mostrato in Fig. supplementare. 4, confrontando la conformazione di AMPQD a FH4 e trimethoprim a FH4, ci sono sottili differenze nelle buste di van der Waals. Le varianti di fuga trimethoprim eDHFR di E. coli DHFR possiedono mutazioni che bloccano anche la funzione inibitoria di AMPQD57. Studiando le differenze nelle interazioni, si può cercare altri ligandi che minimizzano queste differenze di interazione con FH2 e FH4. Ciò potrebbe garantire che le mutazioni, che diminuiscono il legame dell’inibitore, diminuiscano anche l’affinità di legame di FH2 e FH4.

Clustering di 162 strutture DHFR in base al loro Ca RMSD a coppie dei loop Met20. Le strutture DHFR sono rappresentate da cerchi riempiti in blu (umani), verde (eDHFR) e rosso (in questo studio). La lunghezza del bordo (colorata in viola per le conformazioni occluse e oro per quelle chiuse, rispettivamente) è proporzionale al massimo RMSD dei conformatori ad anello Met20. Si prega di consultare un diagramma di clustering più dettagliato nelle informazioni supplementari

Sovrapposizione di complessi AMPQD (verde) e FH4 (giallo). I loop Met20 sono mostrati come cartoni animati e ligandi come bastoni. La vista a destra viene ruotata di 90° in senso orario attorno all’asse verticale dalla prospettiva mostrata a sinistra

Caratterizzazione di un complesso ternario di eDHFR

Infine, in un eDHFR: FH2:NADP (H)complesso ternario con ligando endogeno co-purificato e cofattori (Fig. 10), abbiamo scoperto che il ciclo Met20 diventa disordinato. Ciò sostiene il ruolo del legame del cofattore nel migliorare il campionamento conformazionale per lo scambio rapido del legante o nel facilitare il rilascio del prodotto tramite un meccanismo allosterico (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. La porzione di ribosio nicotinamide oscilla dal sito attivo (Fig. 10) simile al complesso ternario FH4 occluso12. Il suo stato redox è sconosciuto in base alla densità elettronica. La capacità di isolare diversi complessi endogeni legati al legante, binari e ternari di eDHFR in diverse condizioni di cristallizzazione suggerisce che l’eDHFR contiene una miscela di specie molecolari con diversi leganti legati e un insieme di conformazioni. L’efficacia dell’approccio cristallografico qui applicato sfrutta la disomogeneità molecolare omettendo la fase di dialisi per isolare una struttura cristallina complessa FH4 a lungo perseguita e chimicamente labile. Ciò è opposta al processo tipico che comprende il pretrattamento dei campioni di DHFR dalla dialisi, che rimuove i leganti endogeni della traccia ed aumenta l’omogeneità del campione. Una migliore omogeneità migliora generalmente il tasso di successo complessivo degli esperimenti di co-cristallizzazione o di ammollo dei cristalli, quando i ligandi di interesse vengono introdotti in modo esogeno.

Viste stereo del complesso ternario DHFR:FH2:NADP(H). Il loop Met20 disordinato (residui tra Ile14 e Pro21) è indicato come linee tratteggiate nere. La mappa omissione Fo-Fc a un livello 3.0 σ è mostrata come mesh rossa. Strutture secondarie sono mostrati come cartoni animati e ligandi in una rappresentazione bastone. Gli atomi sono colorati come segue: carbonio (bianco), azoto (blu), ossigeno (rosso) e fosforo (arancione)