Timeless TCID50: una soluzione a molti virus
Questo mese copriamo un vecchio classico, il test Tissue Culture Infectious Dose 50, o TCID50. Il test TCID50 viene utilizzato per quantificare i titoli virali determinando la concentrazione alla quale il 50% delle cellule infette mostra effetto citopatico (CPE). Finché il virus di interesse causa la morte cellulare, questo test ha il vantaggio di essere economico e facile da implementare anche quando non sono disponibili anticorpi specifici per virus. In effetti, sono necessarie pochissime informazioni sul virus stesso, rendendolo uno strumento chiave per studiare nuovi agenti patogeni emergenti.
TCID50 assay: cos’è e come usarlo
In un test TCID50, le diluizioni seriali di un virus vengono aggiunte su monostrati di cellule e lasciate fino a quando il CPE non può essere visto. A questo punto, l’effetto della diluizione seriale sulle cellule può essere valutato in modo discontinuo o continuo. In modo discontinuo, la diluizione singola in cui il 50% delle cellule mostra CPE viene utilizzata per quantificare approssimativamente la quantità di virus presente nello stock originale. Questo è abbastanza semplice e non richiede ulteriori analisi. Tuttavia, viene anche con un grado di inesattezza, in quanto non consente di distinguere con precisione all’interno della stessa diluizione.
Informazioni più accurate possono essere ottenute in modo continuo utilizzando una lettura colorimetrica, ad esempio un substrato metabolico con assorbanza specifica, dove la quantità di segnale acquisito è proporzionale al numero di cellule vive. I valori di assorbanza delle diverse diluizioni possono essere quindi tracciati in una curva dose-risposta di regressione continua non lineare, dalla quale sarà possibile estrapolare valori TC50 più accurati. Il metodo discontinuo è sufficiente se non è richiesto un titolo preciso o per determinare quale concentrazione di virus è necessaria per ottenere una certa percentuale di infezione nei test a valle (un vantaggio del TCID50 è che può essere eseguito sulla linea cellulare di interesse, purché il virus causi CPE). Tuttavia anche in questi casi può essere meglio usare diluizioni pieghe tra 1: 2 e 1: 5 per migliorare la precisione. Quando invece è necessaria una quantificazione più accurata, ad esempio quando si confrontano gli effetti di diversi trattamenti o mutazioni sui titoli del virus, si può preferire un metodo colorimetrico.
Dalle diluizioni ai titoli
I valori TCID50 forniscono un’indicazione di quanto virus è necessario per avere CPE nel 50% delle cellule. Ma come passare da questo alla quantità effettiva di virus per ml? La formula è abbastanza semplice e consiste nel moltiplicare il valore TCID50 per 0,7. Ciò deriva dalla distribuzione di Poisson applicata all’infezione virale che afferma che, in una linea cellulare completamente permissiva, la probabilità di raggiungere il 50% di infezione è raggiunta da una molteplicità di infezione di circa 0,7. Questo non è sempre vero, ma è una buona approssimazione per la maggior parte delle applicazioni.
I problemi di contare i virus
Preciso come si può essere, contare i virus non è mai facile. In primo luogo, le diluizioni seriali sono-per loro natura – una fonte di errore. In secondo luogo – e questo è particolarmente rilevante per alti titoli di virus-anche il volume più piccolo che rimane attaccato alla fine di una punta della pipetta può trasportare abbastanza particelle virali per fare una differenza sostanziale nella quantificazione. In terzo luogo, la variazione biologica del sistema è elevata. Piastra la stessa quantità di cellule, aggiungere la stessa quantità di virus, fermare l’infezione allo stesso tempo, e la percentuale di infezione può essere vicino, ma mai esattamente lo stesso.
Infine, nel valutare un trattamento che (come si spera!) diminuisce i titoli del virus, la quantità di virus può scendere al di sotto della soglia di rilevamento del test.
L’arte di contare i virus
La buona notizia è che una volta che conosci i tuoi problemi non sei lontano da una soluzione! La precisione nella diluizione seriale può essere ridotta dall’automazione, ma anche quando questo non è disponibile, alcuni piccoli suggerimenti possono fare la differenza. Questi includono cambiare le punte della pipetta e non inserire mai una punta della pipetta più profonda di un millimetro nella diluizione successiva, per evitare di trasportare accidentalmente alcuni ceppi extra di virus che si sono appena bloccati sulla plastica esterna. Anche le repliche sono importanti, a maggior ragione per i saggi miniaturizzati. 96 well plates consentono la gestione simultanea di più campioni in un modo che più metodi a basso throughput (come il test della placca) non consentirebbero, ma presentano un’ulteriore variabilità, poiché i piccoli volumi sono ancora più sensibili ai problemi discussi sopra. Mentre le repliche tecniche vanno in qualche modo per affrontare questo, a VRS cerchiamo di eseguire esperimenti che richiederanno un TCID50 colorimetrico in triplice copia biologica. Ciò aumenta la robustezza dell’approccio e consente di escludere punti spuri nel set di dati senza perdere significato. Valori TC50 accurati richiederanno una regressione dose-risposta non lineare dei dati colorimetrici, che programmi come GraphPad Prism possono facilmente generare. Tuttavia, la capacità di qualsiasi software di tracciare questo tipo di curva dipenderà strettamente dalla qualità dei dati e dai valori numerici vicini delle repliche. Un’ispezione visiva delle curve e dei valori TC50 generati è altamente raccomandata per correggere situazioni in cui l’estrapolazione è stata distorta da punti dati spuri. Soprattutto, la nostra esperienza suggerisce che oltre alle titolazioni standard di virus, gli esperimenti che richiederanno la lettura TCID50 potrebbero richiedere ulteriori passaggi di ottimizzazione, sia per determinare le migliori condizioni biologiche che assicureranno la raccolta a monte di quantità riproducibili di virus (ad es. linea cellulare di scelta, formato della piastra, molteplicità dell’infezione, punti temporali) e la migliore gamma di concentrazioni da testare sul test TCID50 (ad esempio concentrazione iniziale e piega di diluizione).
Morte cellulare o belle foto?
Contare le cellule morte non è facile, poiché molto spesso abbandonano la piastra al primo lavaggio-supposto che siano ancora lì in primo luogo! Questo non aiuta con precisione. Sebbene sia più costoso e laborioso, ogni volta che è disponibile un buon anticorpo, la colorazione dell’immunofluorescenza è l’approccio che generalmente sceglieremmo. Il test può essere interrotto prima della morte cellulare e la sensibilità è generalmente più alta, il che consente un maggiore controllo e una maggiore precisione. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per i virus che non causano CPE, o che richiedono molto tempo per farlo (e lascia la faccia, alcune belle immagini di un virus in azione sono molto più edificante!). Il danno cellulare, tuttavia, è il marchio di fabbrica della maggior parte delle infezioni e di diversi virus emergenti di cui sappiamo molto poco. Diversi reporter colorimetrici / fluorescenti sono ora disponibili per misurare sensibilmente e distinguere tra diversi tipi di citotossicità. Sembra che questo vecchio classico è per nuove sfide!