La estructura cristalina de una dihidrofolato reductasa unida a tetrahidrofolato revela el origen de la liberación lenta del producto

Aislamiento por cristalización del complejo DHFR de E. coli unido a tetrahidrofolato endógeno (6s)-5,6,7,8

La estructura del eDHFR:El complejo binario FH4 se determinó mediante reemplazo molecular utilizando el complejo ternario cerrado eDHFR:Folato:NADP+ (PDB ID: 7DFR)50. Como se muestra en la Fig. 2, la densidad electrónica clara confirma el ligando endógeno co-purificado como FH4 basado en la geometría tetraédrica de sp3 C6 consistente con un estereoisómero 6s. Esto contrasta con la geometría plana trigonal de sp2 C6 en un complejo binario FH2 obtenido de condiciones de cristalización similares.

Comparación de las estructuras de ligandos de los complejos eDHFR:FH4 (verde, figura superior) y eDHFR:FH2 (naranja, figura inferior). Los mapas de densidad electrónica omit de Fo-Fc contorneados alrededor de los ligandos se muestran a un nivel 3.0 σ. Las vistas de la derecha giran 90° en sentido contrario a las agujas del reloj sobre el eje vertical desde las perspectivas que se muestran a la izquierda. FH4 y FH2 se muestran como palos. El átomo de carbono C6 está coloreado en magenta, y sus diferentes estados de hibridación en FH4 y FH2 están indicados por flechas apuntando en magenta. Todos los demás átomos están coloreados de la siguiente manera: oxígeno en rojo, nitrógeno en azul, carbono en verde y naranja para FH4 y FH2, respectivamente. Solo se muestran átomos que no son de hidrógeno para simplificar la visualización

En un esfuerzo por entender por qué obtenemos el complejo FH4, mientras que otros han fallado, identificamos que el origen de los dos complejos de ligandos diferentes (FH4 vs.FH2) es el momento de la cosecha de cristales y, por lo tanto, la duración del crecimiento de los cristales. Un estudio de curso de tiempo que se muestra en la Fig. 3 que sigue a los cambios de densidades de electrones del ligando unido en diferentes días de crecimiento cristalino reveló que la desintegración de FH4 a FH2 (reflejada en la transición de sp3 a sp2 en la posición C6) ocurrió aproximadamente 2-3 días después de la configuración de cristalización.

Las vistas estéreo del curso temporal de Fo-Fc omiten los cambios de mapa de densidad electrónica correspondientes a la conversión de FH4 a FH2. Los mapas de densidad electrónica omit de Fo-Fc contorneados alrededor de los ligandos se muestran a un nivel 3.0 σ. El eDHFR:Los cristales complejos binarios FH4 se cultivaron en la oscuridad a temperatura ambiente. En cada momento, un único cristal de una gota de cristal independiente se recolectaba mediante congelación instantánea para difracción de rayos X. Las estructuras de ligandos de FH4 y FH2 de estructuras complejas binarias completamente refinadas a los 2 y 14 días, respectivamente, se muestran en cada figura como referencias para comparar con el cambio de densidades de electrones. Los mapas de omisión para los cristales cosechados a los 3 y 6 días se generaron después del refinamiento estructural inicial sin introducir ligandos ni disolventes. La superposición de las estructuras proteicas se realizó con PyMOL69

Esta es la primera vez que sabemos que se ha aislado un auténtico complejo DHFR de dominio único ligado a FH4. Hemos validado el protocolo para reproducir la cristalización del complejo eDHFR: FH4 y confirmado el curso temporal de la desintegración de FH4 a FH2 en al menos dos réplicas independientes en cada punto temporal de recolección de cristales (Fig. Suplementaria. 1). Las densidades electrónicas intermedias a lo largo del curso temporal de la desintegración del ligando muestran claramente la transición de sp3 a sp2 en la posición C6 y la rotación concomitante del anillo benzoil del ligando unido (Fig. 3). Esto puede parecerse a la conformación del ligando del estado de transición en la dirección catalítica delantera. El decaimiento observado de FH4 a FH2 durante el crecimiento cristalino probablemente no refleja la catálisis inversa por DHFR que implica la conversión de FH4 a FH2. También es probable que no sea inducida por la luz, teniendo en cuenta que las gotas de cristalización se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante el crecimiento de los cristales, y el curso temporal de la descomposición de FH4 a FH2 es del orden de los días. También hemos probado la co-cristalización con los agentes reductores ditiotreitol (TDT) o Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a una concentración de 2-3 mm, así como la introducción de TDT o TCEP durante hasta 20 minutos de remojo de cristales antes de la cosecha a 2 días, 3 días, 14 días hasta 7,5 meses. De nuevo, estos procedimientos no afectaron cualitativamente la reproducibilidad de los cambios de densidad electrónica de ligandos a lo largo del curso del tiempo de desintegración del complejo eDHFR:FH4 en la forma cristalina identificada en este estudio (Fig.Suplementaria. 1). Por lo tanto, es probable que el protocolo de cristalización actual cristalice preferentemente el complejo endógeno FH4 co-purificado en las muestras de proteína eDHFR, y su descomposición en el cristal es irreversible en las condiciones que probamos, probablemente debido a la oxidación a un nivel finito de oxígeno. Aunque la rápida reacción catalítica de producción de FH4 a partir de FH2 se ve favorecida termodinámicamente en presencia de exceso de NADPH como en vivo, la descomposición lenta del complejo FH4 de vuelta a un complejo FH2 puede ocurrir sin un suministro continuo de NADPH como observamos aquí bajo la condición de cristalización in vitro. Por lo tanto, el misterio de por qué el complejo FH4 tan buscado era difícil de obtener se revela como su inestabilidad intrínseca. Es muy probable que la clave de nuestro éxito en la obtención de la estructura compleja químicamente lábil FH4 sea la recolección oportuna de cristales de difracción de pozos dentro de los 2 días de crecimiento bajo la condición de cristalización identificada aquí. Además, un estudio del campo DHFR indica que muchos cristalográficos19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 y RMN12,13,15,17,19,25,26 estudios de diálisis aplicada DHFR para eliminar ligandos endógenos antes de introducir los ligandos exógenos de interés. Identificamos una condición de cristalización que aísla el complejo DHFR unido a FH4 endógeno sin diálisis de la muestra de proteína ni introducción de sustratos o productos adicionales. Postulamos que la condición de cristalización actual para el complejo eDHFR:FH4 favorece la forma unida a FH4 sobre otras formas como el complejo ternario eDHFR:FH2:NADP(H).

Caracterización estructural del complejo eDHFR:FH4

El complejo FH4 adopta una conformación ocluida en eDHFR (ver Figs. 4 y 5). Esto es consistente con los hallazgos previos que sugieren que todos los complejos binarios y ternarios FH4 en estado fundamental del ciclo catalítico (transferencia posthidruro y conversión de sp2 a sp3 en C6) ocurren en conformaciones ocluidas. Esto se debe al choque estérico del anillo de pterina inclinado de FH4 con el anillo de nicotinamida de NADP(H), que ocurriría en la conformación cerrada del bucle Met20 (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Como se indica en la Fig. 4, FH4 tiene contactos de van der Waals e interacciones polares favorables con residuos y aguas del sitio activo. En particular, dos puentes salinos bidentados con Asp27 y Arg57 anclan los dos extremos de FH4, aminopirimidina (N3 y exocíclico-NH2) y α-carboxilato, respectivamente, en posiciones casi idénticas a las de los complejos de sustrato/analógicos12, 20,24,45.

La estructura del sitio activo del complejo eDHFR: FH4 se muestra en vistas estéreo. las cadenas laterales a (cian) dentro de 4 Å de FH4 (verde) y el bucle Met20 (amarillo) se muestran como palos. Las estructuras secundarias se muestran como dibujos animados en gris, y las aguas dentro de 3,5 Å de FH4 como esferas. Las interacciones polares con FH4 se indican con líneas discontinuas. El mapa de densidad electrónica Fo–Fc omitiendo FH4 se muestra a un nivel 3,5 σ en rojo y el mapa de omisión 2Fo–Fc a un nivel 1,0 σ se muestra en azul para residuos y aguas. Los tres conformadores de los enlaces de amida Ile14-Gly15 están indicados por un círculo discontinuo y flechas rojas. b Una vista ampliada de la Ile14-Gly15 vinculación

Superposición del complejo FH4 con complejos analógicos FH2 y FH4. Los complejos actuales FH4, FH2 y eDHFR reportados y el complejo 5-formil-FH4 reportado junto con sus conformaciones de bucle Met20 ocluidas, residuos Phe31 y los ligandos correspondientes están coloreados en verde, magenta y amarillo, respectivamente. Todas las demás estructuras del PDB IDs: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20 y 4PSY (folato:NADP+)20 son de color gris. El círculo rojo indica propuesto π–π interacciones entre Phe31 y el ligando benzoyl los grupos que adoptan dos orientaciones distintas dependiendo de los ligandos unidos. FH4 y 5-formil-FH4 pertenecen a un grupo en contraste con ddFH4, FH2 y folato, mientras que las cadenas laterales Phe31 permanecen en casi la misma posición en todas las estructuras alineadas. Los bucles Met20 se clasifican en tres estados conformacionales generales, cerrados, parcialmente cerrados y ocluidos. Solo las conformaciones cerradas pueden acomodar estructuralmente el grupo nicotinamida del cofactor NADP(H) que entra en el sitio activo

Hay dos moléculas de agua que unen el bucle Met20 y el FH4 a través de una red de enlace de hidrógeno que involucra Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) y Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Estas interacciones están ausentes en los complejos dideazatetrahidrofolato (ddFH4) reportados previamente (6R)-5,10-12,45 debido al reemplazo de N a C en las posiciones 5 y 10 en el análogo. Esto podría causar la diferencia observada en la conformación Met20 en el análogo en comparación con el complejo FH4 (Fig. 5). Las únicas estructuras disponibles en el PDB que se parecen mucho a la conformación de bucle Met20 en el complejo FH4 son un complejo 5-formil-FH4 (Fig. 5, PDB ID: 1JOM) 51 y dos complejos inhibidores alostéricos eDHFR-nanobody que apuntan a diferentes epítopos DHFR con afinidad nanomolar(Fig. 2, PDB IDs: 3K74 y 4EIG) 28,29. El complejo 5-formil-FH4 conserva el agua de puente entre Glu17 (NH) y FH4(N10) como en el complejo FH4, a pesar de sus diferentes grupos espaciales P61 y P212121 respectivamente. 5-Formil-FH4, también conocido como ácido folínico o leucovorina, es un medicamento de «rescate» aprobado por la FDA para prevenir los efectos dañinos del metotrexato durante la quimioterapia53. El grupo γ-carboxílico de FH4 muestra poca densidad electrónica (Fig. 4), sugiriendo desorden o más libertad de rotación de enlaces alrededor del eje Cß-Cy o Cy-Cδ que en otras partes de los ligandos.

Además de la red de agua, se encontró el origen estructural de las interacciones estabilizadoras en el complejo FH4 y la liberación lenta del producto con base en la comparación estructural de complejos binarios FH4 y FH2 actuales y estructuras eDHFR reportadas previamente. En primer lugar, el contacto de van der Waals con la cadena lateral Glu17 da lugar a un blindaje adicional del FH4 frente al disolvente (Fig. 4) que está ausente en el sustrato o en el análogo del producto (6R)-5,10-dideazatetrahidrofolato complejos12,20,24,45. En segundo lugar, la clara densidad electrónica de tres conformaciones troncales alternativas del enlace de amida Ile14-Gly15 conservado sugiere una contribución entrópica a la estabilidad del complejo FH4 a partir de la flexibilidad local en el anclaje de bucle Met20 (Fig. 4). En particular, estudios previos de mutagénesis mostraron que Ile14 es crucial para controlar la flexibilidad del bucle Met20, mientras que las variantes I14V, I14A e I14G mostraron una tasa de transferencia de hidruros más lenta, una mayor flexibilidad del bucle Met20 observada en una conformación abierta en estructuras cristalinas, una mayor dependencia de la temperatura del efecto isotópico cinético primario y una mayor energía de activación del estado de transición calculada a partir de simulaciones híbridas de QM/MM23, 40. En tercer lugar, la rotación del anillo de benzoilo conduce a interacciones π-π de borde a cara electrostáticamente favorables con el Fe31 conservado en el complejo FH4, en contraste con las interacciones repulsivas protón-cerca de protón (borde a borde) en los complejos FH2, folato y ddFH4, independientemente de la unión a NADP(H) (Fig. 5, vista ampliada, Fig. 6)54,55. La implicación funcional de este cambio estructural también está respaldada por la observación de la rotación concomitante del anillo benzoílo y la transición de sp3 a sp2 en la posición C6 del ligando unido durante el curso temporal de la desintegración de FH4 a FH2 en el complejo (Fig. 3). El papel de la Fe31 en el control de la liberación de producto se corrobora aún más en estudios previos de mutagénesis56, que demostraron que las variantes F31V y F31Y de eDHFR mostraron un aumento de dos veces de la constante de velocidad en estado estacionario kcat y un aumento estimado de 20 a 50 veces en la velocidad de liberación de producto, además del efecto de las mutaciones en la ralentización de la transferencia de hidruros.

Interacciones electrostáticas de sistemas π-π. Ver refs 54,55 para más detalles

Teniendo en cuenta las propiedades dinámicas del sistema DHFR de E. coli en particular, el complejo eDHFR:FH4 ocluido estable (un intermedio de baja energía libre en su paisaje dinámico) observado aquí puede ser razonablemente la base de la cinética de liberación lenta del producto (tasa koff de disociación de FH4, el paso limitador de velocidad del ciclo catalítico eDHFR). De acuerdo con estudios previos de dispersión de relajación por RMN, cada paso del ciclo catalítico de E. coli DHFR sigue un mecanismo de «selección de conformación» en lugar de un mecanismo de «ajuste inducido» 15. En consecuencia, la velocidad microscópica de cada paso a lo largo de la coordenada de reacción depende de la velocidad de muestreo conformacional de la enzima15 (por ejemplo, el estado de transición competente para la transferencia rápida de hidruros o la liberación de producto limitante de velocidad). Esto implica que cuanto más estable sea el estado fundamental, y cuanto más diferente sea de la subestación excitada, mayor será el costo de energía libre requerido para muestrear tales conformaciones. Para eDHFR, esto implicará necesariamente la reorganización del sitio activo y el bucle Met20 flexible. Se propuso en los estudios de dispersión de relajación por RMN del eDHFR15 que el estado excitado subpoblado para el paso químico de transferencia de hidruros adopta una conformación ocluida (cuyo estado fundamental del complejo Michaelis está en una conformación cerrada). Sin embargo, el estado excitado subpoblado para el paso de liberación del producto adopta una conformación cerrada (cuyo complejo FH4 en estado fundamental se encuentra en una conformación ocluida). A lo largo de la coordenada de reacción, el complejo binario eDHFR:FH4 observado actualmente reside entre los complejos intermedios eDHFR:FH4:NADP+ y eDHFR:FH4:NADPH (Fig. 1). Ambos adoptan conformaciones ocluidas, en las que la fracción nicotinamida del cofactor apunta lejos del sitio activo15. Para tomar muestras de la «subestación excitada cerrada» durante el paso de liberación del producto limitador de velocidad 15, debe producirse una reorganización activa del sitio desde el estado fundamental ocluido. Esto está representado por el intermedio catalítico estable eDHFR: FH4 capturado en este estudio. La tasa de disociación del producto koff de FH4 se incrementó al unirse al cofactor con un aumento de dos veces para eDHFR: FH4: NADP+ en comparación con eDHFR:FH4, y un aumento de ocho veces para eDHFR: FH4: NADPH en comparación con eDHFR:FH4 medido a pH 6 y pH 9 por experimentos de competición35. Esto indica una liberación acelerada del producto y un aumento de las tasas de muestreo conformacional cuando se une un cofactor. Aunque nunca se había informado de una estructura de estado fundamental del complejo ternario eDHFR:FH4:NADPH auténtico, planteamos la hipótesis de que puede haber una similitud apreciable con el complejo binario eDHFR:FH4, ya que todos los estados intermedios terrestres ligados a FH4 adoptan una conformación ocluida15. Sin embargo, esperamos que la unión de cofactores aumente la población de las subestaciones excitadas, propuestas previamente en base a estudios de dispersión de relajación de RMN para estar en una conformación cerrada15. De acuerdo con esto, observamos que en un complejo ternario de la estructura eDHFR:FH2:NADP(H) (también determinado en nuestro estudio bajo condiciones de cristalización separadas), el bucle Met20 se desordenó. Esto sugiere un mecanismo general de intercambio de ligandos facilitado por el cofactor al mejorar la tasa de muestreo conformacional cuando el cofactor está unido a su fracción de nicotinamida apuntando lejos del sitio activo.

En el complejo FH4, la distancia entre el anillo benzoílo FH4 (c1ʹ) y el Phe31 (Cz) es de 4,93 Å, que es significativamente más corta (~0,3–0,6 Å) que las distancias correspondientes en los complejos FH2 actuales y FH2 reportados previamente (PDB ID: 1RF7, 4PDJ)20,24, que son 5,22, 5,55 y 5,32 Å, respectivamente. Una tendencia similar de acortamiento de distancia a lo largo de la coordenada de reacción de eDHFR fue enfatizada en dos estudios computacionales independientes. Un estudio de QM / MM calculó que la distancia correspondiente se acorta en ~0,3 Å desde el complejo de Michaelis al estado de transición a medida que se produce la reacción de transferencia de hidruros y que hay poca diferencia en esta distancia (~0,01 Å) entre el estado de transición y el producto de reacción27. Otro estudio que utiliza una dinámica molecular mixta cuántica / clásica sugirió un acortamiento más dramático de la distancia correspondiente en ~1 Å a medida que la reacción evoluciona del reactivo al estado de transición18. Por lo tanto, nuestras observaciones cristalográficas están en general de acuerdo con los modelos computacionales anteriores, lo que sugiere que, hasta cierto punto, el complejo FH4 preserva la naturaleza física del estado de transición. Esto también es consistente con observaciones anteriores sobre el paisaje de energía dinámica de eDHFR mapeado por dispersión de relajación de RMN que cada intermedio en el ciclo catalítico muestra estados excitados de baja altitud cuyas conformaciones se asemejan a estructuras de estado fundamental de los intermedios precedentes o siguientes15. Dado que las enzimas estabilizan el estado de transición, la liberación lenta del producto de la familia DHFR podría atribuirse al traspaso de la naturaleza física del estado de transición al complejo de producto de reacción. Esto se sugiere a partir del complejo FH4 de larga data determinado aquí, además de los cambios conformacionales específicos de la especie requeridos durante el ciclo catalítico32.

La caracterización de un complejo ocluido de eDHFR con un inhibidor de afinidad de unión nanomolar de inicio lento

La cristalografía de rayos X muestra que el complejo de eDHFR con un inhibidor apretado de inicio lento AMPQD46 también muestra la conformación ocluida. El bucle Met20 adoptó una conformación en el complejo AMPQD que se asemeja a la del complejo ternario con una biguanida antidiabética fenformina y NADP+ (PDB ID: 5UIH) 52. Por otro lado,el metotrexato, agente quimioterapéutico aprobado por la FDA, se demostró previamente mediante cristalografía de rayos x24, 47, RMN48 y cinéticas monomoleculares49 que se unía en la conformación DHFR cerrada (Fig. 7). Esta discrepancia en las conformaciones de proteínas fue inesperada ya que los tres inhibidores comparten una característica estructural común: el grupo biguanida de la fenformina, el grupo diaminopirimidina de la AMPQD y el grupo diaminopterina del metotrexato, cada uno conectado a un grupo fenilo con un enlazador flexible. Sin embargo, un examen detallado de la superposición estructural de los complejos inhibidores de eDHFR correspondientes (Fig. 7) mostró que el grupo de enlace metilamino del metotrexato (ausente en fenformina y AMPQD) ocupaba una posición que daría lugar a un choque estérico potencial con el bucle Met20 si adoptaba una conformación ocluida como en los complejos fenformina y AMPQD. Anteriormente, demostramos que la AMPQD mostraba una preferencia relativamente mayor (una disminución de tres veces en el CI-50 y el Ki) para inhibir el eDHFR en comparación con el DHFR46 humano. Una especificidad de especie aún mayor para E. se observa coli sobre DHFR humano (~30 veces) para el compuesto original de AMPQD, que carece del grupo de cola de aminofenilo y del enlace de metileno 46. La estructura cristalina actual del complejo ocluido de eDHFR con AMPQD proporciona una explicación mecanicista plausible para su especificidad de especie, atribuible a las diferencias en los equilibrios conformacionales de DHFR humano vs.eDHFR. El primero se observa exclusivamente en conformaciones cerradas, mientras que el segundo muestra una mayor flexibilidad conformacional en conformaciones cerradas y ocluidas, como se discutirá a continuación.

Estructura del complejo inhibitorio eDHFR:AMPQD. una vista estéreo de las interacciones del sitio activo con AMPQD con el mapa de omisión Fo-Fc a un nivel σ de 3,5. Las cadenas laterales de proteínas (cian) dentro de 4 Å de AMPQD (verde) se muestran como barras, incluidos dos residuos del bucle Met20 (amarillo). Las interacciones polares se indican con líneas discontinuas. b Superposición de complejos AMPQD (verde), fenformina (amarillo, PDB: 5UIH)52 y metotrexato (gris mostrado como barras delgadas de PDB: 1RA3, 1DDS)20,47. Los bucles Met20 se muestran como dibujos animados y los ligandos como palos. Las estructuras químicas de los ligandos se dibujan en la parte superior. NADP (H) no se muestra en ninguna de las estructuras para simplificar la visualización

Comparación de conformaciones DHFR basadas en clustering

Un clustering de estructuras PDB DHFR utilizando el RMSD de los átomos Ca troncales de bucle Met20 como métrica de distancia (Fig. 8 y Suplemento Fig. 3) indica que el DHFR humano adopta exclusivamente una conformación cerrada (catalíticamente competente para la unión al NADPH), mientras que el eDHFR es mucho más flexible con conformaciones cerradas y ocluidas. Las conformaciones ocluidas se observan con menos frecuencia (17%) en estructuras eDHFR. Tanto el complejo de liberación de producto limitante de velocidad con FH4 como el complejo inhibitorio de inicio lento con AMPQD adoptan una conformación ocluida de eDHFR (Fig. 9) que rara vez se representa en el AP (Fig.Suplementaria. 3). Curiosamente,tanto el FH4 como el AMPQD comparten las características de afinidad nanomolar y liberación lenta del eDHFR35,36, 46 con la posición de los átomos clave de nitrógeno en los heterociclos fuertemente conservados, y las diferencias evidentes en las colas. Esto sugiere una nueva estrategia para desarrollar inhibidores de DHFR dirigidos a conformaciones de eDHFR ocluidas. También proponemos una estrategia para combatir la resistencia a los medicamentos. Como se muestra en la Fig. 4, al comparar la conformación de AMPQD a FH4 y trimetoprima a FH4, hay diferencias sutiles en los sobres de van der Waals. Las variantes de escape EDHFR de trimetoprima de E. coli DHFR poseen mutaciones que también bloquean la función inhibitoria de la AMPQD57. Al estudiar las diferencias en las interacciones, uno puede buscar otros ligandos que minimicen estas diferencias de interacción con FH2 y FH4. Esto podría garantizar que las mutaciones, que disminuyen la unión de inhibidores, también disminuyan la afinidad de unión de FH2 y FH4.

Agrupación de 162 estructuras DHFR basadas en su Ca RMSD en parejas de los bucles Met20. Las estructuras DHFR están representadas por círculos rellenos de azul (humanos), verde (eDHFR) y rojo (en este estudio). La longitud del borde (coloreado en púrpura para las conformaciones ocluidas y dorado para las conformaciones cerradas, respectivamente) es proporcional al RMSD máximo de los conformadores de bucle Met20. Consulte un diagrama de agrupación más detallado en la Información complementaria

Superposición de complejos AMPQD (verde) y FH4 (amarillo). Los bucles Met20 se muestran como dibujos animados y los ligandos como palos. La vista de la derecha gira 90° en el sentido de las agujas del reloj sobre el eje vertical desde la perspectiva que se muestra a la izquierda

Caracterización de un complejo ternario de eDHFR

Finalmente, en un eDHFR: FH2:Complejo ternario NADP(H) con ligando endógeno co-purificado y cofactores (Fig. 10), encontramos que el bucle Met20 se vuelve desordenado. Esto apoya el papel de la unión de cofactores para mejorar el muestreo conformacional para el intercambio rápido de ligandos o facilitar la liberación del producto a través de un mecanismo alostérico (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. La fracción ribosa de nicotinamida se aleja del sitio activo (Fig. 10) similar al complejo ternario FH4 ocluido 12. Su estado redox es desconocido en base a la densidad electrónica. La capacidad de aislar diferentes complejos eDHFR ligados a ligandos endógenos, binarios y ternarios en condiciones de cristalización variables sugiere que eDHFR contiene una mezcla de especies moleculares con diferentes ligandos unidos y un conjunto de conformaciones. La eficacia del enfoque cristalográfico aplicado aquí aprovecha la falta de homogeneidad molecular al omitir el paso de diálisis para aislar una estructura cristalina compleja FH4 químicamente lábil perseguida desde hace mucho tiempo. Esto se opone al proceso típico que implica el pretratamiento de muestras de DHFR por diálisis, que elimina los ligandos endógenos traza y aumenta la homogeneidad de la muestra. La homogeneidad mejorada generalmente mejora la tasa de éxito general de los experimentos de co-cristalización o remojo de cristales, cuando los ligandos de interés se introducen exógenamente.

Vistas estéreo del complejo ternario DHFR:FH2:NADP(H). El bucle Met20 desordenado (residuos entre Ile14 y Pro21) se indica como líneas discontinuas negras. El mapa de omisión Fo-Fc a un nivel 3.0 σ se muestra como malla roja. Las estructuras secundarias se muestran como dibujos animados y ligandos en una representación de bastón. Los átomos se colorean de la siguiente manera: carbono (blanco), nitrógeno (azul), oxígeno (rojo) y fósforo (naranja)