utviklingen og gradvise forbedringer av gjær-to-hybridsystemet (Y2H) siden tidlig på 90-tallet revolusjonerte måten proteininteraksjoner kunne oppdages1.
Gjær to-hybrid er basert på rekonstituering av en funksjonell transkripsjonsfaktor (TF) når to proteiner eller polypeptider av interesse interagerer. Dette skjer i genetisk modifiserte gjærstammer, hvor transkripsjonen av et reportergen fører til en bestemt fenotype, vanligvis vekst på et selektivt medium eller endring i fargen på gjærkoloniene. De mest populære reportergenene ER HIS3 for å velge gjær på et medium som mangler histidin, og LacZ for å skjerme gjær i en kolorimetrisk analyse.
de tekniske detaljene Til En Gjær To-Hybrid-Analyse er skissert i tegneserien nedenfor.
To fusjoner (‘hybrider’) er konstruert mellom hvert protein av interesse og ENTEN DNA-Bindende Domene (DBD) eller Aktiveringsdomenet (AD) AV TF. Proteinet smeltet TIL DBD er referert til som ‘agn’, og proteinet smeltet TIL ANNONSEN som ‘byttedyr’.
ved interaksjon mellom agn og byttedyr, blir DBD og AD brakt i umiddelbar nærhet og en funksjonell TF rekonstitueres oppstrøms av reportergenet. De mest populære fusjoner bruker dbd og AD av gjæren Tf Gal4. Bakterieproteinet LexA brukes også ofte SOM EN DBD i kombinasjon Med Gal4 AD.
som en genetisk teknikk tilbyr en gjær to-hybridskjerm et følsomt og kostnadseffektivt middel for å teste den direkte samspillet mellom to målrettede proteiner, eller å bruke ens favorittprotein som agn for å skjerme biblioteker av proteinfragmenter fremstilt fra de ønskede celletyper, vev eller hele organismer. Identiteten til de samspillende partnerne oppnås da ved sekvensering av de tilsvarende plasmider i de valgte gjærkoloniene. Samlinger Av full lengde proteiner (‘ORFeomes’) blir også tilgjengelige for flere arter, men de dekker ikke hele proteomet ennå.
gjær to-hybrid system ble raskt vedtatt av det vitenskapelige samfunn og skjermer i ulike arter og forskningsfelt allerede ført til dusinvis av tusenvis av publikasjoner. Det er fortsatt den valgte metoden når det gjelder å oppdage nye proteininteraksjoner, som reflektert av den nylig publiserte litteraturen.
Variasjoner AV Y2H ble utviklet for å gjennomføre skjermer i nærvær av en ko-faktor, eller et enzym som kreves for en gitt post-translasjonell modifikasjon av proteinpartnere2.
Andre versjoner tillater å skjerme integral membran proteiner3 og teknikken ble tilpasset for å oppdage protein-protein-interaksjoner i pattedyrceller4. Til slutt, gjær n-hybrid protokoller ble også utviklet for å skjerme for nye DNA-protein5, RNA-protein6 og små molekyl-protein interaksjoner7.
Oppdag Hybrigenics nyeste optimaliserte Gjær To-Hybrid Skjerm tjeneste: ULTImate Y2H.
Kontakt våre team av forskere for gratis råd om prosjektet.
1. Fields, S. Og Song, O. et nytt genetisk system for å oppdage protein-protein-interaksjoner (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. Og Arpin, M. Romlig rekruttering og aktivering Av Fes-kinasen av ezrin fremmer HGF-indusert cellespredning (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. A. s., A. S., A. S., A. S., A. S., A. S., a. S., a. S., a. S., a. S., a. S. Et genetisk system basert på split-ubiquitin for analyse av interaksjoner mellom membranproteiner in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, a., Der Heyden, Jv, Lemmens, I., Ostade, Xv, Vandekerckhove, j. Og Tavernier, J. Design Og anvendelse av en cytokinreseptorbasert interaksjonsfelle (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, Jj og Herskowitz, I. Isolering AV ORC6, en komponent av gjæropprinnelsesgjenkjenningskomplekset ved et hybridsystem (1993) Vitenskap 262(5141), 1870-1874
6. Jørgensen, A., Jørgensen, a. og Jørgensen, A. En tri-hybrid system for analyse og påvisning AV RNA-protein interaksjoner (1996) Nukleinsyrer Res 24, 4838-4840
7. Licitra, Ej Og Liu, Jo et tre-hybridsystem for detektering av små ligand-protein
reseptorinteraksjoner (1996) PNAS 93(23), 12817-12821