Tidløs TCID50: en løsning på mange virus
Denne måneden dekker vi en gammel klassiker, Vevskulturinfeksjonsdose 50-analysen eller TCID50. TCID50-analysen brukes til å kvantifisere virale titre ved å bestemme konsentrasjonen der 50% av de infiserte cellene viser cytopatisk effekt (CPE). Så lenge viruset av interesse forårsaker celledød, har denne analysen fordelen av å være billig og enkel å implementere også når virusspesifikke antistoffer ikke er tilgjengelige. Faktisk er det svært lite informasjon om selve viruset, noe som gjør det til et viktig verktøy for å studere nye og nye patogener.
tcid50-analyse: hva det er og hvordan du bruker det
i EN TCID50-analyse blir serielle fortynninger av et virus tilsatt monolag av celler, og igjen til CPE kan ses. På dette punktet kan effekten av seriell fortynning på cellene skåres enten på en diskontinuerlig eller kontinuerlig måte. På en diskontinuerlig måte brukes enkeltfortynningen der 50% av cellene viser CPE til å kvantifisere mengden virus som er tilstede i den opprinnelige bestanden. Dette er ganske enkelt og krever ingen videre analyse. Men det kommer også med en grad av unøyaktighet, da det ikke tillater å skille nøyaktig innenfor samme fortynning.
Mer nøyaktig informasjon kan oppnås på en kontinuerlig måte ved å bruke en kolorimetrisk avlesning, f. eks. et metabolsk substrat med spesifikk absorbans, hvor mengden signal som er oppnådd, er proporsjonal med antall levende celler. Absorbansverdiene for de forskjellige fortynningene kan deretter plottes i en kontinuerlig ikke-lineær regresjonsdose-responskurve, hvorfra det vil være mulig å ekstrapolere mer nøyaktige tc50-verdier. Diskontinuerlig metode er tilstrekkelig dersom en nøyaktig titer ikke er nødvendig, eller for å bestemme hvilken konsentrasjon av virus som er nødvendig for å oppnå en viss prosentandel infeksjon i nedstrømsanalyser (en fordel MED TCID50 er at den kan utføres på cellelinjen av interesse, så lenge viruset forårsaker CPE). Men selv i disse tilfellene kan det være bedre å bruke fortynninger folder mellom 1: 2 og 1: 5 for å forbedre nøyaktigheten. Når i stedet en mer nøyaktig kvantifisering er nødvendig, for eksempel når man sammenligner effekten av forskjellige behandlinger eller mutasjoner på virustitre, kan en kolorimetrisk metode foretrekkes.
fra fortynninger til titre
tcid50-verdier gir en indikasjon på hvor mye virus SOM trengs FOR Å ha CPE i 50% av cellene. Men hvordan går du fra dette til den faktiske mengden virus per ml? Formelen er ganske enkel, og den består i å multiplisere tcid50-verdien med 0,7. Dette kommer fra poisson-distribusjonen som brukes på virusinfeksjon, som sier at i en fullt permissiv cellelinje oppnås sannsynligheten for å nå 50% infeksjon ved en rekke infeksjoner på omtrent 0,7. Dette er ikke alltid sant, men det er en god tiln rming for de fleste applikasjoner.
problemene med å telle virus
så nøyaktig som man kan være, telle virus er aldri lett. For det første er serielle fortynninger – av egen natur – en feilkilde. For det andre – og dette er spesielt relevant for høye titre av virus-selv det minste volumet som forblir festet til enden av en pipettespiss, kan bære nok viruspartikler til å gjøre en betydelig forskjell i kvantifiseringen. For det tredje er den biologiske variasjonen av systemet høy. Plate samme mengde celler, legg til samme mengde virus, stopp infeksjonen samtidig, og prosentandelen infeksjon kan være nær, men aldri akkurat det samme.
Til slutt, når du vurderer en behandling som (som du håper!) reduserer virustitre, mengden av virus kan falle under testdeteksjonsgrensen.
kunsten å telle virus
den gode nyheten er at når du kjenner dine problemer, er du ikke langt fra en løsning! Nøyaktighet i seriell fortynning kan reduseres ved automatisering, men selv når dette ikke er tilgjengelig, kan noen små tips gjøre forskjellen. Disse inkluderer å bytte pipettespisser og aldri sette inn en pipettespiss dypere enn en millimeter i neste fortynning, for å unngå at du ved et uhell bærer over noen ekstra logger av virus som nettopp ble sittende fast på den ytre plasten. Replikater er også viktige, og jo mer for miniatyriserte analyser. 96 brønnplater tillater samtidig håndtering av flere prøver på en måte som mer lav gjennomstrømningsmetoder (som plakkanalyse)ikke ville tillate, men de kommer med ekstra variabilitet, da små volumer er enda mer følsomme for problemene som er diskutert ovenfor. Mens tekniske replikater går noe for å løse dette, prøver VI PÅ VRS å kjøre eksperimenter som vil kreve en kolorimetrisk TCID50 i biologisk triplikat. Dette øker robustheten i tilnærmingen og gjør det mulig å utelukke falske punkter i datasettet uten å miste betydning. Nøyaktige tc50-verdier vil kreve en ikke-lineær regresjonsdose-respons av kolorimetriske data, som programmer som GraphPad Prism enkelt kan generere. Imidlertid vil evnen til programvare til å plotte denne typen kurve strengt avhenge av kvaliteten på dataene, og på de nære numeriske verdiene til replikatene. En visuell inspeksjon av kurvene og tc50-verdiene som genereres, anbefales sterkt for å korrigere situasjoner der ekstrapoleringen har blitt skjev av falske datapunkter. Fremfor alt tyder vår erfaring på at utover standard virustitreringer, kan eksperimenter som krever TCID50-avlesning, trenge ytterligere trinn for optimalisering, både for å bestemme de beste biologiske forholdene som vil sikre oppstrøms samling av reproduserbare mengder virus (f. eks. cellelinje, plateformat, multiplikasjon av infeksjon, tidspunkter), og det beste konsentrasjonsområdet for å teste PÅ tcid50-analysen(f. eks.
Celledød eller fine bilder?
Å Telle døde celler Er ikke lett, da de ofte forlater platen ved første vask-antatt at de fortsatt er der i utgangspunktet! Dette hjelper ikke med nøyaktighet. Selv om det er dyrere og arbeidskrevende, når et godt antistoff er tilgjengelig, er immunfluorescensfarging den tilnærmingen vi vanligvis ville velge. Analysen kan stoppes før celledød og følsomheten er generelt høyere, noe som gir mer kontroll og høyere nøyaktighet. I tillegg kan denne metoden brukes til virus som ikke forårsaker CPE, eller som tar lang tid å gjøre det (og la oss innse det, noen fine bilder av et virus i aksjon er langt mer oppløftende!). Celleskader er imidlertid varemerket for de fleste infeksjoner og av flere nye virus som vi vet svært lite om. Flere kolorimetriske / fluorescerende reportere er nå tilgjengelige for sensitivt å måle og skille mellom ulike typer cytotoksisitet. Det ser ut som denne gamle klassikeren er opp for nye utfordringer!