de rol van Eiwitmodificaties van T-Bet in cytokineproductie en differentiatie van T-helpercellen

Abstract

t-Bet (T-box eiwit uitgedrukt in T-cellen, ook wel TBX21 genoemd) werd oorspronkelijk gekloond als een belangrijke transcriptiefactor die betrokken was bij de commitment van T-helpercellen (Th) aan de th1-lijn. T-Bet activeert direct IFN-gen transcriptie en verbetert de ontwikkeling van th1 cellen. T-Bet moduleert gelijktijdig IL-2 en Th2 cytokines op een IFN-onafhankelijke manier, resulterend in een verzwakking van th2 celontwikkeling. Talrijke studies hebben aangetoond dat t-bet veelvoudige rollen in vele subtypes van immune cellen, met inbegrip van B-cel, dendritische cellen, natural killer (NK) cellen, NK T cellen, en ingeboren lymfoïde cellen speelt. Daarom is T-bet cruciaal voor de ontwikkeling en coördinatie van zowel aangeboren als adaptieve immuunreacties. Om deze veelvoudige rollen te vervullen, ondergaat t-bet verscheidene posttranslational eiwitwijzigingen, zoals phosphorylation bij tyrosine, serine, en threonineresidu ‘s, en ubiquitination bij lysineresidu’ s, die lijnverbintenis tijdens de celdifferentiatie van th beà nvloeden. Dit overzicht presenteert een actueel overzicht van de vooruitgang in het begrijpen van de rollen van diverse types van t-bet eiwitwijzigingen in de verordening van cytokineproductie tijdens de celdifferentiatie.

1. Inleiding

T-Bet (T-box eiwit uitgedrukt in T cellen, ook wel TBX21 genoemd) werd voor het eerst beschreven in 2000 in een rapport dat de effecten van T-bet op de differentiatie van T helper 1 (Th1) cellen onderzocht . Voor de afgelopen 15 jaar, hebben vele studies de functies van t-bet onderzocht en veelvoudige rollen voor deze proteã ne tijdens de celdifferentiatie van th, met een nadruk op de moleculaire mechanismen betrokken, de nieuwe functies van deze transcriptiefactor in ingeboren immune cellen, en t-bet-bemiddelde modulatie van ontstekingsziekten geopenbaard . Er is verduidelijkt dat T-bet een cruciale rol speelt in de coördinatie van aangeboren immuniteit en adaptieve immuniteit en dat het een belangrijke functie vervult bij het moduleren van chronische ontstekingsziekten, waaronder astma en inflammatoire darmziekte, door het controleren van een netwerk van zeer geconserveerde genetische programma ‘ s . Dus, optimale regulering van t-bet expressie en activiteit lijkt gunstig te zijn voor het voorkomen of behandelen van chronische ontsteking en auto-immuunziekten.

hoewel er pogingen zijn gedaan om de kleine moleculen te identificeren die de expressie en activiteit van t-bet regelen en die de T-celgemedieerde immuunrespons beïnvloeden, is er tot op heden weinig vooruitgang geboekt. Gezien het belang van T-bet in de immuunregulatie, zou het ophelderen van de functionele mechanismen die ten grondslag liggen aan de veelvoudige rollen van T-bet de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies voor de behandeling van chronische inflammatoire en auto-immuunziekten vergemakkelijken. Dit overzicht geeft een samenvatting van de huidige stand van kennis over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de veelvoudige rollen gespeeld door t-bet in th celontwikkeling.

2. Structuur van T-Bet

De t-bet bevat een amino-terminus, een T-box-domein en een carboxyl-terminus, die respectievelijk 82%, 100% en 79% homologie vertonen tussen muizen (530 aminozuurresidu-eiwit) en mensen (535 aminozuurresidu-eiwit) (figuur 1). Het T-box domein, gelegen tussen de residuen 135 en 326 in Muis t-bet, is zeer behouden in 18 leden van de T-box proteïne (TBX) familie . De gemeenschappelijke die eigenschappen door T-Doos proteã nen worden gedeeld omvatten een capaciteit voor de band van DNA door het T-Doos domein en transcriptional regelgevende activiteit, die een rol in het controleren van de uitdrukking van ontwikkelingsgen in alle diersoorten speelt.

figuur 1

structuur en eiwit modificatie van t-bet. Muis en mens T-bet is 100% identiek in het T-box domein. Verscheidene aminozuurresiduen worden in muizen behouden en ondergaan posttranslationele wijzigingen, met inbegrip van fosforylatie bij serine, threonine, en/of tyrosineresidu ‘s, en ubiquitination bij lysineresidu’ s.

het T-box domein bestaat uit ongeveer 180 aminozuurresiduen en is zowel voldoende als noodzakelijk voor binding aan de consensus DNA sequentie TCACACCT . Brachyury (T) was het eerste T-box-eiwit dat werd geïdentificeerd en in dimere vorm interageert het met de grote en de kleine groeven van DNA door hydrofobe interacties en ongewoon carbonylcontact in de hoofdketen met een guanine als dimeer . TBX1 bindt ook aan de opeenvolging van DNA als dimeer, terwijl TBX2 aan de zelfde opeenvolging van DNA als monomeer schijnt te binden . Hoewel tbx1 en tbx2 61% identiteit delen in het T-box domein, lijkt de structuur van het DNA-T – box bindingscomplex anders te zijn, vanwege de lage homologie tussen de amino-en carboxyl-terminale gebieden. Het T-box domein in T-bet toont 50% homologie met het corresponderende domein in brachyury (t), TBX1 en TBX2; echter, de kristalstructuur van T-bet gebonden aan de DNA-sequentie moet nog gekarakteriseerd worden.

3. Regulering van de celdifferentiatie door T-Bet

3.1. Stimulatie van th1-celdifferentiatie door T-Bet

T-bet bindt rechtstreeks aan de consensus-DNA-sequentie binnen de ifng-promotor en activeert de transcriptie ervan. De t-bet-veroorzaakte uitdrukking van IFNG leidt TH precursorcellen af om in th1 effectorcellen te onderscheiden. Terwijl exogene t-bet-overexpressie in naïeve TH-cellen bij voorkeur de ontwikkeling van Th1-cellen verhoogt, leidt t-bet-deficiëntie tot het niet produceren van voldoende IFN-γ en vermindert daardoor de aanmaak van Th1-cellen . T-Bet-expressie wordt aanzienlijk verhoogd door stimulatie van de T-celreceptor (TCR) en wordt versterkt door co-behandeling met IFN-γ en IL-12. IFN-γ bindt aan zijn receptor en induceert activering van signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT) 1 en transcriptie van t-bet gen (tbx21). Vervolgens stimuleert T-bet direct de transcriptie van IFNG en IL12RB2. De expressie van IL-12-receptor (IL-12R) β2 op het celoppervlak verbetert de IFN-γ-productie door IL-12 en de STAT4-signaalweg verder, wat resulteert in preferentiële th1-celdifferentiatie. Interessant, afgedwongen t-bet uitdrukking kan ook omzetten de gedifferentieerde th2 cellen in th1 cellen . Daarom wordt t-bet op de crux van de regelgevende wegen geplaatst die IFN-γ in th cellen veroorzaken.

3.2. De vermindering van de IL-2-productie door T-Bet

naast de IFN-γ-verordening onderdrukt T-bet de expressie aanzienlijk. Dit cytokine, een vroege de celgroei factor van T, is essentieel voor activering, proliferatie, en differentiatie van th cellen en overvloedig geproduceerd op TCR stimulatie. Ectopisch geà ntroduceerde T-bet onderdrukt de IL-2-productie aanzienlijk door remming van de nucleaire factor kB (NF-kB) P65-activiteit, onder voorwaarden van zowel th1 als Th2-differentiatie . Tijdens th1 celdifferentiatie, IL-2 transcriptie wordt ook verzwakt op inductie van t-bet. De t-bet-gemedieerde IL-2-remming kan de TH-celuitbreiding beïnvloeden en de th1-gemedieerde immuunrespons op voortreffelijke wijze moduleren na blootstelling aan een pathogeen antigeen.

3.3. Suppressie van de ontwikkeling van Th2-cellen door t-Bet

bovendien onderdrukt de exogene introductie van t-bet in th-cellen de productie van th2-cytokines, zoals IL-4, IL-5 en IL-13, via suppressie van GATA-bindend eiwit-3 (GATA-3). Dienovereenkomstig induceert een gebrek aan T-bet spontane Th2-celontwikkeling in vitro en in vivo . De th2-suppressieve activiteit van T-bet werd ook bevestigd in afwezigheid van IFN-γ, wat erop wijst dat T-bet Een discrete remmende functie heeft, onafhankelijk van IFN-γ-stimulatie.

3.4. Andere functies van T-Bet

onlangs hebben vele studies gemeld dat T-bet ook andere TH-cellijnen moduleert, waaronder Th17 -, Treg-en folliculaire TH-cellen (TFH-cellen), in coördinatie met vele transcriptiefactoren, zoals de retinoic acid-related orphan receptor-yt (RORyt), runt-related transcription factor 3 (RUNX3) en B-cellymfoom-6 (BCL6) . Deze bevindingen suggereren dat t-bet een transcriptiefactor is die van cruciaal belang is voor het fijnafstellen van de celontwikkeling van th.

4. Posttranslationele wijziging van T-Bet

T-Bet functioneert als een multitasking-speler in de regulering van th-celdifferentiatie. Nochtans, blijven de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de stimulatory en remmende activiteit van t-bet in het regelen van de uitdrukking van het doelgen worden verduidelijkt. Vele multitasking proteã nen zijn gekend om posttranslational eiwitmodificaties te ondergaan en cellot te bepalen door directe stimulatory en indirecte remmende activiteit op de uitdrukking van het doelgen uit te oefenen .

4.1. Tyrosinefosforylering van t-Bet

detectie op basis van antilichamen van t-bet-eiwitten in western blots resulteert in meerdere banden, wat wijst op de posttranslationele modificatie van t-bet in TCR-getriggerde TH-cellen. Tyrosine phosphorylation van t-bet proteã ne komt hoofdzakelijk tijdens de vroege stadia (dagen 2 tot 3) van de celontwikkeling van Th, op TCR betrokkenheid voor, en neemt daarna af. Het behandelen van th-cellen met de inhibitor pervanadate van tyrosinefosfatase verbetert de tyrosinefosforylatie van t-bet. T-Bet wordt hoofdzakelijk gelokaliseerd in de kern, en het nucleaire tyrosinekinase IL2-induceerbare tyrosinekinase (ITK) werd geà dentificeerd als verantwoordelijk upstream tyrosinekinase. ITK-deficiëntie voorkomt tyrosinefosforylatie van t-bet in th-cellen na stimulatie met TCR en IL-12. Mutationeel onderzoek heeft aangetoond dat tyrosineresidu 525 (Y525) de relevante phosphorylation-plaats is en dat phosphorylation op deze plaats een belangrijke rol in de interactie met GATA-3 speelt. Hoewel het T-boxdomein in t-bet belangrijk is voor DNA en eiwit-eiwitinteractie, is de tyrosinefosforylatie van Y525 voorwaarde voor de afschaffing van Gata-3-gemedieerde th2 celdifferentiatie. Blokkade van y525 fosforylering verbreekt de interactie met en onderdrukking van GATA-3, wat resulteert in een verminderde onderdrukking van Th2 .

bovendien induceert een ander nucleair tyrosinekinase, c-Abl, fosforylering van t-bet bij tyrosineresiduen 219, 265 en 304 in Muis T-bet . Een deficiëntie in C-Abl evenals mutatie van T-bet bij deze residuen (y219/265 / 304F mutanten) leidt tot een mislukking om de inductie van IFN-γ te verhogen en de productie van th2 cytokine te onderdrukken, wegens het verlies van fosforylering bij deze tyrosineresiduen. Dit, op zijn beurt, resulteert in de verergering van allergische longontsteking in vivo . Deze bevindingen suggereren dat ITK – en c-Abl-geïnduceerde tyrosinefosforylatie van t-bet essentieel is voor de modulatie van th2-celontwikkeling en de allergische immuunrespons.

4.2. Serinefosforylering van T-Bet

hoewel t-bet-gemedieerde suppressie van de th2-celontwikkeling wordt verminderd door mutatie van Y525 en de afwezigheid van C-Abl-kinase, blijft IL-2 suppressie behouden met een Y525-mutant T-bet, wat wijst op het bestaan van een aanvullend reguleringsmechanisme voor IL-2-modulatie . Interessant, zou de verschijning van veelvoudige banden van t-bet proteã ne Op Westelijke vlekken door de toevoeging van kalfsintestinale fosfatase kunnen worden geëlimineerd, die phosphorylation bij serine/threonineresidu ‘ s hoofdzakelijk elimineert. De spectrometrische analyse van de massa onthulde toen serine 508 (S508) als een andere phosphorylation plaats in t-bet. Mutatie van S508 elimineert caseïne kinase – (CK -) en glycogeensynthase kinase-3 (GSK-3 -) gemedieerde fosforylering in t-bet, evenals de IL–2-suppressieve activiteit van het eiwit. Bovendien is S508 fosforylering belangrijk voor de interactie van t-bet met NF-kB p65 en voor het voorkomen van binding van NF-kB p65 aan de il2-promotor. In overeenstemming met de functie van T-bet als NF-kB P65-remmer, ondersteunen t-bet-null Th1-cellen NF-kB p65-activiteit tijdens th1-celdifferentiatie en produceren zo meer IL-2. Daarom is gesuggereerd dat t-bet een fysiologische remmer is van IL-2 tijdens th1 celdifferentiatie, door S508 phosphorylation-afhankelijke onderdrukking van NF-kB p65.

4.3. Threoninefosforylering van T-Bet

zeer recent werd threonine 302 (T302) gekarakteriseerd als een nieuwe fosforylatieplaats in T-bet , hoewel het onduidelijk blijft welke kinase en fosfatase de fosforylering van dit residu beïnvloeden. Echter, herstel van T-bet-null TH cellen met een T302-mutant t-bet stimuleerde IFN-γ productie net zo veel als wild-type t-bet; echter, de mutant faalde om IL-2 en andere th2 cytokines te onderdrukken. Verdere analyse toonde aan dat T302-fosforylering nodig is voor de interactie van t-bet met de kernfactor van geactiveerde T-cellen (NFAT) en voor downregulatie van NFAT-gemedieerde IL-2-en Th2-cytokines, zoals IL-4, IL-5 en IL-13. NFAT is niet cruciaal voor de inductie van de IFN-γ-productie en T302-mutant T-bet kan zich binden aan de ifng-promotor; de IFN-γ-productie was dus vergelijkbaar tussen wild-type en mutant t-bet. Met andere woorden, mutatie van T302 verbrak de t-bet-gemedieerde onderdrukking van IL-2 en Th2 cytokine productie maar had geen invloed op de DNA-binding en IFN-γ-stimulerende activiteit van T-bet.

T302 bevindt zich inderdaad in de DNA-bindende T-box, net als Y304 . Het T-boxdomein bestaat uit verscheidene herhalingen van β-bundels en α-helices en is betrokken bij zowel dimerisatie als DNA-binding . Muller en Herrmann voorspelden dat de α-helices aH3 en aH4 in brachyury (T) belangrijk zijn voor de directe interactie van dit eiwit met de kleine en grote groeven van DNA . Nochtans, kan T302 niet direct met de groeven van DNA worden geassocieerd, ongeacht zijn phosphorylation status. Het zou interessant zijn om te weten welke upstream kinase en phosphatase T302 phosphorylation regelt en of T302 phosphorylation andere eiwitwijzigingen van t-bet beïnvloedt.

4.4. Ubiquitinatie van lysine 313 in t-Bet

t-bet-expressie is van cruciaal belang voor de transcriptionele regulatie van IFNG en voor de ontwikkeling van Th1-cellen, maar de wijze van regulatie van t-bet op het eiwitniveau moet nog worden vastgesteld. Jang et al. hebben onlangs gemeld dat t-bet ubiquitinatie-gemedieerde proteasomale degradatie ondergaat tijdens de latere stadia van th1 celdifferentiatie . Van de 16 lysineresiduen die aanwezig zijn in het t-bet-eiwit van muizen, bevinden 11 zich voornamelijk in het T-box-domein en de overige 5 bevinden zich in het carboxyl-eindpunt (residuen 326 tot en met 530), terwijl er geen lysineresiduen aanwezig zijn in het amino-eindpunt (residuen 1 tot en met 134). Interessant, zijn de lysineresiduen binnen het T-boxdomein bij voorkeur ubiquitinated op overexpressie van ubiquitin. Verdere analyse heeft aangetoond dat de mutatie van lysine 313 (K313) de ubiquitinatie-gemedieerde t-bet degradatie vermindert en het expressieniveau van T-bet in de kern en het cytoplasma verbetert. Ondanks de verhoogde niveaus van de k313-mutant, heeft deze mutatie de t-bet-functies volledig ingetrokken, waaronder DNA-binding, transcriptionele activering van IFNG en onderdrukking van IL-2-en Th2-cytokineproductie. De kristalstructuur van de α-helices van het aan DNA gebonden t-boxdomein suggereert sterk dat de aminogroep van K313 met het Fosfaat van een DNA-base via waterstof-binding interactie wordt geassocieerd. Bovendien leidt mutatie van K313 ook tot falen om de productie van IL-2 en Th2 cytokine te onderdrukken; echter, de interactie met en onderdrukking van GATA-3 en NF-kB p65 worden niet veranderd door mutatie van K313. Interessant, wordt de interactie NFAT afgeschaft in k313-mutant t-bet, die ook sterk met een afwezigheid van phosphorylation bij T302 wordt geassocieerd. Het is nog niet duidelijk of en hoe k313 T302 fosforylering reguleert en vice versa.

5. T-Bet bij inflammatoire en auto-immuunziekten

sinds Mosmann et al. ontdekte th1 en Th2 subsets die handtekening cytokines produceren, IFN-γ, en IL-4, IL-5, en IL-13, respectievelijk, en die ontstekings en allergische immune reacties moduleren, hebben verdere studies nieuwe subsets van th cellen, zoals Th17, TFH, en Treg cellen geïdentificeerd . De uitgebreide studies hebben ook de cytokine kenmerkende wegen en transcriptiefactoren betrokken bij de verordening van immune reacties op ziekteverwekkers gekenmerkt . Belangrijk is dat T-bet Een fundamentele rol speelt bij het beheersen van differentiatie van verschillende subgroepen van th-cellen en bij het moduleren van ontstekings-en auto-immuunziekten .

T-Bet functioneert ook als een antiastmatische regulator. Een tekort aan t-bet leidt spontaan tot de ontwikkeling van astmatische symptomen, die wordt gekenmerkt door verhoogde eosinofiele infiltratie in de luchtwegen, slijm-afscheidende kelk cel hyperplasie, en chronische luchtweg remodellering met collageenaccumulatie en proliferatieve myofibroblasten; deze kenmerken worden vaak ook gezien bij astmatische patiënten . Herstel van t-bet expressie verschuift de immuunbalans naar een th1 respons en voorkomt en verzwakt pathologische longontsteking in vivo .

bovendien is T-bet beschermd tegen intracellulaire pathogene infecties. Intrekking van t-bet-geïnduceerde IFN-γ productie resulteerde in een hogere gevoeligheid voor intracellulaire pathogenen in vivo, waaronder Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major en Salmonella typhimurium, waarbij het belang van IFN-γ productie door T-bet-expressie Th1 cellen in de verdediging tegen bacteriële infecties werd benadrukt. Nochtans, zijn t-bet-deficiënte muizen resistent tegen besmetting door Listeria monocytogenes, omdat de inf-γ productie door natuurlijke moordenaarscellen zowel noodzakelijk als voldoende is voor de gastheerbescherming tegen L. monocytogenes .

bovendien kan T-bet de ontwikkeling van inflammatoire en auto-immuunziekten verergeren, waaronder inflammatoire darmziekten, experimentele auto-immuunencefalomyelitis, inflammatoire artritis en type I diabetes, aangezien deze ontstekingsziekten worden afgezwakt in afwezigheid van T-bet . Deze bevindingen suggereren dat fine-tuning van de immuunrespons door modulatie van t-bet expressie gunstige effecten zou kunnen hebben voor patiënten met chronische astma, inflammatoire darmziekte, artritis, multiple sclerose en diabetes.

6. Conclusies en perspectieven

T-bet is een T-box-domein-bevattende transcriptiefactor die typisch betrokken is bij ontwikkelingsregulatie, maar meerdere functies uitoefent in th-celdifferentiatie; transcriptionele activering van IFN-γ-expressieve Th1-cellen, indirecte onderdrukking van th2 -, Th17-en Treg-celontwikkeling, en fijnmodulatie van IL-2-productie in Th1-cellen. Deze multitasking is niet verwonderlijk, aangezien T-bet verschillende posttranslationele wijzigingen ondergaat. Phosphorylation bij Y525 speelt een rol in Gata-3 afschaffing tijdens th2 regelgeving, phosphorylation bij S508 veroorzaakt NF-kB P65 afschaffing in de context van IL-2 regelgeving in th1 cellen, phosphorylation bij T302 speelt een rol in fine-tuning IL-2 productie, en ubiquitination bij K313 speelt een rol in het controleren van de eiwitstabiliteit van t-bet. Dus, posttranslationele wijziging van t-bet vergemakkelijkt de functionele diversiteit en de complexiteit van de modulatie van cytokine expressie (Figuur 2). Het is niet bekend of de verschillende posttranslationele modificaties sequentieel of gelijktijdig voorkomen, of een type eiwitmodificatie andere modificatie beïnvloedt, of dat veranderingen in de posttranslationele modificatie van T-bet gerelateerd zijn aan de ontwikkeling van infectieuze en chronische ontstekingsziekten. De verdere identificatie van nieuwe eiwitwijzigingen met betrekking tot t-bet functies zou waardevolle inzichten in de ontwikkeling van krachtige therapeutische interventies voor het controleren van chronische inflammatoire en auto-immune ziekten verstrekken.

Figuur 2

meerdere t-bet functies spelen een rol in th cel differentiatie. De inductie van t-bet-expressie door activering van STAT1 en STAT4 stimuleert direct de transcriptie van t-boxbindende elementen bevattende genen, zoals IFNG, IL12RB2 en CXCR3, waardoor de Th1-celontwikkeling wordt verbeterd. T-Bet ondergaat serinefosforylering bij S508 en reguleert vervolgens de IL-2-productie in Th1-cellen door NF-kB p65 van de il2-promotor te rekruteren. De eiwitniveaus van t-bet in th1 cellen kunnen door de ubiquitin-gemedieerde proteasomale degradatieweg worden gecontroleerd. Bovendien, ondergaat de proteã ne van t-bet extra posttranslational wijzigingen, bijvoorbeeld, phosphorylation bij T302 en Y525, die zijn afschaffing van de th2 cytokineproductie vergemakkelijkt die door activering van NFAT en GATA-3 wordt veroorzaakt.

lijst van afkortingen

belangenconflicten

er is geen potentieel belangenconflict bekendgemaakt.

erkenning

dit werk werd ondersteund door het mid-Career Researcher Program via NRF Grant (2013R1A2A2A01068302).