Timeless Tcid50: One solution to many viruses
deze maand behandelen we een oude klassieker, De Tissue Culture Infectious Dose 50 assay, of TCID50. De tcid50-analyse wordt gebruikt om virale titers te kwantificeren door de concentratie te bepalen waarbij 50% van de besmette cellen cytopathisch effect (CPE) vertonen. Zolang het virus van belang celdood veroorzaakt, heeft deze analyse het voordeel om goedkoop en gemakkelijk te implementeren ook wanneer virusspecifieke antilichamen niet beschikbaar zijn. In feite is zeer weinig informatie over het virus zelf vereist, waardoor het een belangrijk hulpmiddel is om nieuwe en opkomende ziekteverwekkers te bestuderen.
tcid50-Test: Wat is het en hoe wordt het gebruikt
In een tcid50-test worden seriële verdunningen van een virus toegevoegd aan monolagen van cellen, waarna CPE kan worden waargenomen. Op dit punt kan het effect van de seriële verdunning op de cellen worden gescoord op een discontinue of continue manier. Op discontinue wijze wordt de enkelvoudige verdunning waarbij 50% van de cellen CPE vertonen, gebruikt om de hoeveelheid virus in de oorspronkelijke stam ongeveer te kwantificeren. Dit is vrij eenvoudig en vereist geen verdere analyse. Echter, het komt ook met een mate van onnauwkeurigheid, omdat het niet toestaat om nauwkeurig te onderscheiden binnen dezelfde verdunning.
meer nauwkeurige informatie kan op continue wijze worden verkregen door gebruik te maken van een colorimetrische uitlezing, bijv. een metabolisch substraat met specifieke absorptie, waarbij de hoeveelheid verkregen signaal evenredig is met het aantal levende cellen. De absorptiewaarden van de verschillende verdunningen kunnen vervolgens worden uitgezet in een continue niet-lineaire dosis-responscurve voor regressie, waaruit nauwkeuriger TC50-waarden kunnen worden geëxtrapoleerd. De discontinue methode is voldoende als een precieze titer niet nodig is, of om te bepalen welke virusconcentratie nodig is om een bepaald percentage infectie te verkrijgen in downstream assays (een voordeel van de TCID50 is dat het kan worden uitgevoerd op de cellijn van belang, zolang het virus CPE veroorzaakt). Maar zelfs in deze gevallen kan het beter zijn om verdunningen vouwen tussen 1:2 en 1:5 te gebruiken om de nauwkeurigheid te verbeteren. Wanneer in plaats daarvan een nauwkeuriger kwantificering nodig is, bijvoorbeeld bij het vergelijken van het effect van verschillende behandelingen of mutaties op virustiters, kan een colorimetrische methode de voorkeur krijgen.
van verdunningen tot titers
TCID50-waarden geven een indicatie van de hoeveelheid virussen die nodig is om CPE te hebben in 50% van de cellen. Maar hoe ga je van dit naar de werkelijke hoeveelheid virus per ml? De formule is vrij eenvoudig en bestaat uit het vermenigvuldigen van de tcid50 waarde met 0,7. Dit komt van de poissondistributie toegepast op virale besmetting die stelt dat, in een volledig permissieve cellijn, de waarschijnlijkheid om 50% besmetting te bereiken door een veelheid van besmetting van ongeveer 0.7 wordt bereikt. Dit is niet altijd waar, maar het is een goede benadering voor de meeste toepassingen.
de problemen bij het tellen van virussen
zo nauwkeurig als men kan zijn, is het tellen van virussen nooit gemakkelijk. Ten eerste zijn seriële verdunningen-naar hun aard – een bron van fouten. Ten tweede – en dit is met name relevant voor hoge virustiters-kan zelfs het kleinste volume dat aan het eind van een pipettip blijft hangen, genoeg virusdeeltjes bevatten om een wezenlijk verschil in de kwantificering te maken. Ten derde is de biologische variatie van het systeem hoog. Plaat dezelfde hoeveelheid cellen, voeg dezelfde hoeveelheid virus, stop de infectie op hetzelfde moment, en het percentage van de infectie kan dicht, maar nooit precies hetzelfde.
ten slotte, bij het beoordelen van een behandeling die (zoals je zou hopen!) vermindert virustiters, kan de hoeveelheid virus onder de detectiedrempel van de assay vallen.
de kunst van het tellen van virussen
het goede nieuws is dat als u eenmaal uw problemen kent, u niet ver van een oplossing bent! De nauwkeurigheid in seriële verdunning kan worden verminderd door automatisering, maar zelfs als dit niet beschikbaar is, kunnen enkele kleine tips het verschil maken. Deze omvatten het veranderen van pipet tips en nooit een pipetpunt dieper dan een millimeter in de volgende verdunning, om te voorkomen dat per ongeluk dragen over een aantal extra logs van het virus dat net vast kwam te zitten op de buitenste plastic. De replicaten zijn ook belangrijk, en des te meer voor geminiaturiseerde analyses. 96 goed platen toestaan gelijktijdige behandeling van meerdere monsters op een manier die meer low-throughput methoden (zoals plaque assay) niet zou toestaan, maar ze komen met extra variabiliteit, als kleine volumes zijn nog gevoeliger voor de kwesties hierboven besproken. Terwijl technische replicaten gaan een manier om dit aan te pakken, bij VRS we proberen om experimenten die een colorimetrische TCID50 in biologisch triplicaat zal vereisen uitvoeren. Dit verhoogt de robuustheid van de aanpak en maakt het mogelijk om valse punten in de dataset uit te sluiten zonder verlies van betekenis. Nauwkeurige TC50-waarden vereisen een niet-lineaire regressiedosis-respons van de colorimetrische gegevens, die programma ‘ s zoals GraphPad Prism gemakkelijk kunnen genereren. Echter, de mogelijkheid van een software om dit soort curve te plotten zal strikt afhangen van de kwaliteit van de gegevens, en van de close numerieke waarden van de replicaten. Een visuele inspectie van de gegenereerde krommen en TC50-waarden wordt ten zeerste aanbevolen om situaties te corrigeren waarin de extrapolatie is scheefgetrokken door valse gegevenspunten. Boven alles, onze ervaring suggereren dat naast de standaard virus voorraad titraties, experimenten die tcid50 uitlezen nodig kunnen hebben extra stappen van optimalisatie nodig, beide om de beste biologische omstandigheden die upstream verzamelen van reproduceerbare hoeveelheden virus zal verzekeren te bepalen (bijv. cellijn naar keuze, plaatformaat, veelheid van infectie, tijdpunten) en het beste bereik van concentraties om met de tcid50-test te testen (bv. aanvangsconcentratie en verdunningsvouw).
celdood of mooie foto ‘ s?
het tellen van dode cellen is niet eenvoudig, omdat ze heel vaak de plaat verlaten bij de eerste wasbeurt – verondersteld dat ze er in de eerste plaats nog zijn! Dit helpt niet met nauwkeurigheid. Hoewel duurder en bewerkelijker, wanneer een goed antilichaam beschikbaar is, immunofluorescentie het bevlekken is de benadering die wij over het algemeen zouden kiezen. De analyse kan vóór celdood worden gestopt en de gevoeligheid is over het algemeen hoger, die meer controle en hogere nauwkeurigheid toestaat. Bovendien, deze methode kan worden gebruikt voor virussen die geen CPE veroorzaken, of die een lange tijd duren om dit te doen (en laten we eerlijk zijn, sommige mooie foto ‘ s van een virus in actie zijn veel meer verheffend!). Celbeschadiging is echter het handelsmerk van de meeste infecties en van verschillende opkomende virussen waarvan we heel weinig weten. Verscheidene colorimetrische / fluorescente verslaggevers zijn nu beschikbaar om gevoelig tussen verschillende types van cytotoxicity te meten en te onderscheiden. Het lijkt erop dat deze oude klassieker klaar is voor nieuwe uitdagingen!