5.3 Regulacja celów za pośrednictwem miRNA
w ramach RISC miRNA oddziałuje z genami docelowymi poprzez parowanie zasad. Interakcja między miRNA a docelowym mRNA jest ograniczona do 5 ’ końca miRNA. Komplementarność sekwencji między nukleotydami 2-8, znanymi również jako” region zalążkowy”, jest niezbędna do rozpoznania sekwencji docelowej , chociaż wykazano wyjątki od tej reguły . Najczęściej miejsca wiązania miRNA są obecne w 3′-nieprzetłumaczalnym regionie (UTR) docelowych mRNA, zwykle w wielu kopiach . Wykazano jednak, że miRNA jest również ukierunkowana na 5 ’ – UTR i regiony kodujące mRNA . Badanie przeprowadzone przez Tay et al. wykazano, że sieć miRNA może wiązać się z wieloma miejscami w obrębie kodowania i 3′-UTR pojedynczego celu mRNA, co zwiększa złożoność regulacji celu za pośrednictwem miRNA . Stopień komplementarności między regionem nasiennym miRNA a miejscem wiązania w docelowym mRNA określa mechanizm, za pomocą którego miRNA reguluje cel . Jeśli miRNA zapewnia wystarczającą komplementarność sekwencji (prawie doskonałą) do docelowego mRNA, wówczas Regulacja jest przeprowadzana przez proces zwany interferencją RNA, w którym RISC jest kierowany do rozszczepiania docelowego mRNA . W przypadku niewystarczającej komplementarności, co na ogół ma miejsce u ssaków, regulację uzyskuje się poprzez stłumienie translacji i / lub destabilizację mRNA .
podstawowymi składnikami RISC są rodzina białek Argonaute (Ago), które odgrywają kluczową rolę w jego funkcji . Wszystkie cztery białka AGO ssaków (Ago1-Ago4) mogą kierować translacyjną represją docelowego mRNA, jednak tylko Ago2 posiada aktywność „slicer” i jest odpowiedzialny za rozszczepianie docelowego mRNA . Dokładny mechanizm represji translacyjnej genów docelowych za pośrednictwem miRNA jest nadal niepewny . Kilka badań dostarczyło dowodów na to, że represje translacyjne występują przed rozpoczęciem tłumaczenia . Jednak inne badania sugerują, że represje występują po rozpoczęciu tłumaczenia . Początkowo sądzono, że represyjność genów docelowych za pośrednictwem miRNA jest głównie odzwierciedlana na poziomie białka, bez wpływu lub w minimalnym stopniu na poziom mRNA. Jednakże obecnie wykazano, że represji genów docelowych za pośrednictwem miRNA często wiąże się z destabilizacją mRNA, chociaż nie wiadomo, czy jest to wtórny efekt represji translacyjnej. pośredniczona przez miRNA degradacja celów mRNA obejmuje deadenylację (usunięcie ogona Poli a), a następnie dekapowanie i trawienie egzonukleolityczne . Ponadto uważa się, że organy Przetwarzające (P-bodies), struktury cytoplazmatyczne zaangażowane w Przechowywanie i degradację mRNA, odgrywają również rolę w regulacji miRNA . uważa się, że miRNA kieruje docelowe mRNA i związane z nimi białka RISC do tych struktur magazynujących, które są wzbogacone w czynniki degradacji mRNA i translacyjnej represji . Mechanizmy dyktujące, czy docelowy mRNA podąża ścieżką degradacji, czy translacyjnej represji, są obecnie nieznane. Dodatkowo do złożoności regulacji pośredniczonej przez miRNA należą ostatnie odkrycia, że w różnych warunkach stresowych represji wywołanych przez miRNA celów można odwrócić i że miRNA może aktywować translację docelowego mRNA .
regulacja za pośrednictwem miRNA wydaje się być procesem niezwykle dynamicznym, jego złożoność zwiększa fakt, że doskonała komplementarność do celu nie jest wymagana do regulacji. Oznacza to, że pojedynczy miRNA ma potencjał do regulowania wielu genów docelowych. Ponadto sieć miRNA może funkcjonować jednocześnie, regulując pojedynczy mRNA. To ostatecznie sprawia, że identyfikacja genów docelowych in silico i Wyjaśnienie funkcji miRNA znacznie trudniejsze.
region nasienny, znajdujący się w pozycjach 2-7 od 5′ końca miRNA, jest wykorzystywany przez RISC jako sygnał zarodkowy do rozpoznawania docelowego mRNA . Na mRNA odpowiednie miejsca określane są jako”miejsca zalążkowe”. Istnieje wiele ciągów związanych z rozpoznawaniem i wiązaniem docelowego miejsca nasion . Rygorystyczne miejsce nasienne ma doskonałe wiązanie Watson-Crick i można je podzielić na cztery typy nasion: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 i 6mer . Każdy z tych typów różni się w zależności od kombinacji nukleotydu w pozycji 1 i parowania w pozycji 8. 8mer ma zarówno adeninę w pozycji 1 miejsca docelowego mRNA, jak i parowanie bazy w pozycji 8. Wiadomo, że adenina w miejscu docelowym odpowiadająca pozycji 1 miRNA zwiększa skuteczność rozpoznawania celu . 7mer-A1 ma adeninę tylko w pozycji 1, podczas gdy 7mer-m8 ma parowanie bazowe tylko w pozycji 8. Natomiast 6mer nie ma ani adeniny w pozycji 1, ani parowania bazy w pozycji 8 .
oprócz rygorystycznego rozpoznawania nasion możliwe jest również umiarkowanie rygorystyczne rozpoznawanie, ponieważ RISC może tolerować niewielkie niedopasowania lub chwiejne parowanie w obrębie regionu nasion. Stabilność termodynamiczna pary chwiejnej (takiej jak G:U) jest porównywalna do pary Watson–Crick .
parowanie Watson–Crick w 3′ części cząsteczki miRNA zwiększa skuteczność rozpoznawania miejsc w celach miRNA, które mają parowanie nasion . Preferowana liczba dopasowań nukleotydów w części 3′ różni się między miejscem, które ma rygorystyczne parowanie nasion i miejscem, które ma umiarkowane parowanie nasion. Surowe nasiona wymagają 3-4 meczów na pozycjach 13-16, podczas gdy umiarkowane-surowe-nasiona wymagają 4-5 meczów na pozycjach 13-19. Miejsca z tym dodatkowym 3 'parowaniem nazywane są miejscami 3-dodatkowymi i 3′ kompensacyjnymi .
wykazano, że zdecydowana większość sekwencji rozpoznających cele miRNA znajduje się w 3′-UTR docelowego genu, mimo że RISC obciążone miRNA może teoretycznie wiązać dowolny segment mRNA. Geny docelowe mają zazwyczaj dłuższy 3 'UTR, podczas gdy niektóre wszechobecne geny, takie jak geny utrzymujące Dom, mają tendencję do krótkiego 3′ UTR, potencjalnie aby uniknąć regulacji przez miRNA . Miejsca docelowe nie są równomiernie rozmieszczone z 3 ’ UTR. Znajdują się w pobliżu obu końców na długości 3 ’ UTR (Zwykle ≥2000 nt). Dla krótszego 3 ’ UTR, miejsca docelowe są zwykle ~ 15-20 nt od kodonu stop .
chociaż ogólnie uważa się, że funkcjonalne miejsca miRNA są preferencyjnie zlokalizowane w 3′ UTR, miejsca nasion w sekwencji kodującej i regiony 5′ UTR mogą również promować obniżanie mRNA . Podstawa preferencyjnego miRNA wiążącego w 3 ’ UTR może mieć szereg wyjaśnień. Na przykład RISC może wymagać konkurowania z innymi kompleksami białkowymi, takimi jak rybosomy, wiążącymi się z sekwencją kodującą i kompleksami inicjacji translacji w 5 ’ UTR. W związku z tym 3′ UTR może być po prostu bardziej dostępny do długoterminowego wiązania niż pozostałe dwa miejsca .