struktura krystaliczna reduktazy dihydrofolianowej związanej z tetrahydrofolianem ujawnia pochodzenie powolnego uwalniania produktu

Izolacja przez krystalizację endogennego (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolianowego kompleksu DHFR E. coli związanego z endogennym (6s)-5,6,7,8

kompleks binarny edhfr:FH4 oznaczono przez zastąpienie cząsteczkowe przy użyciu zamkniętego trójskładnikowego kompleksu Edhfr:folate:NADP+ (PDB ID: 7dfr) 50. Jak pokazano na Fig. 2, wyraźna gęstość elektronów potwierdza co-oczyszczony endogenny ligand jako FH4 w oparciu o geometrię czworościenną sp3 C6 zgodną ze stereoizomerem 6s. Stoi to w przeciwieństwie do trygonalnej geometrii płaskiej sp2 C6 w dwuskładnikowym kompleksie FH2 uzyskanym w podobnych warunkach krystalizacji.

porównanie struktur ligandowych kompleksów eDHFR: FH4 (zielony, górny rysunek) i eDHFR:FH2 (pomarańczowy, dolny rysunek). Fo-Fc pomija mapy gęstości elektronów ułożone wokół ligandów są pokazane na poziomie 3,0 σ. Widoki po prawej stronie są obracane o 90° w lewo względem osi pionowej z perspektywy pokazanej po lewej stronie. FH4 i FH2 są pokazane jako kije. Atom węgla C6 jest zabarwiony na magenta, a jego różne stany hybrydyzacji w FH4 i FH2 są oznaczone strzałkami wskazującymi magenta. Wszystkie inne atomy są zabarwione w następujący sposób: tlen na Czerwono, azot na niebiesko, węgiel na zielono i pomarańczowy dla FH4 i FH2, odpowiednio. Dla prostoty oglądania pokazane są tylko atomy nie-wodorowe

starając się zrozumieć, dlaczego otrzymujemy kompleks FH4, podczas gdy inne zawiodły, zidentyfikowaliśmy, że pochodzenie dwóch różnych kompleksów ligandów (FH4 vs. FH2) jest czasem zbierania kryształów, a tym samym czasem wzrostu kryształów. Badanie przebiegu czasu pokazane na Fig. 3, który następuje po zmianach gęstości elektronów związanego ligandu w różnych dniach wzrostu kryształu, ujawnił, że rozpad FH4 do FH2 (odzwierciedlony w przejściu sp3 do sp2 w pozycji C6) wystąpił około 2-3 dni po krystalizacji.

Stereofoniczne widoki przebiegu czasowego Fo-Fc pomijają zmiany mapy gęstości elektronów odpowiadające konwersji FH4 na FH2. Fo-Fc pomija mapy gęstości elektronów ułożone wokół ligandów są pokazane na poziomie 3,0 σ. EDHFR:Dwuskładnikowe kryształy FH4 hodowano w ciemności w temperaturze pokojowej. W każdym punkcie czasowym pojedynczy kryształ z niezależnej kropli kryształu był zbierany przez zamrożenie błyskowe do dyfrakcji rentgenowskiej. Struktury ligandowe FH4 i FH2 w pełni wyrafinowanych dwuskładnikowych struktur złożonych odpowiednio po 2 i 14 dniach są pokazane na każdym rysunku jako odniesienia do porównania ze zmianą gęstości elektronów. Mapy omit dla kryształów zebranych po 3 i 6 dniach zostały wygenerowane po wstępnym udoskonaleniu strukturalnym bez wprowadzania ligandów lub rozpuszczalników. Superpozycję struktur białkowych wykonano za pomocą PyMOL69

po raz pierwszy wiemy, że autentyczny kompleks DHFR z pojedynczą domeną związany z FH4 został wyizolowany. Potwierdziliśmy protokół odtworzenia krystalizacji kompleksu eDHFR: FH4 i potwierdziliśmy przebieg rozpadu FH4 do FH2 przez co najmniej dwa niezależne replikaty w każdym punkcie czasowym zbierania kryształów(Fig. 1). Pośrednie gęstości elektronów wzdłuż czasu rozpadu ligandu wyraźnie pokazują Przejście sp3 do sp2 w pozycji C6 i równoczesny obrót pierścienia benzoilowego związanego ligandu (Fig. 3). Może to przypominać konformację ligandu stanu przejściowego w kierunku katalitycznym do przodu. Obserwowany rozpad FH4 do FH2 podczas wzrostu kryształów prawdopodobnie nie odzwierciedla odwrotnej katalizy przez DHFR z udziałem konwersji FH4 do FH2. Prawdopodobnie nie jest to również indukowane przez światło, biorąc pod uwagę, że krople krystalizacji inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności podczas wzrostu kryształu, a czas rozpadu FH4 do FH2 jest rzędu dni. Testowaliśmy również współkrystalizację ze środkami redukującymi ditiotreitol (DTT) lub tris(2-karboksyetylo)fosfina (TCEP) w stężeniu 2-3 mM, a także wprowadzenie DTT lub TCEP do 20 minut moczenia kryształów przed zbiorem w 2 dni, 3 dni, 14 dni do 7,5 miesiąca. Ponownie, procedury te nie miały wpływu na odtwarzalność zmian gęstości elektronów ligandu jakościowo wzdłuż przebiegu rozpadu kompleksu eDHFR:FH4 w postaci krystalicznej zidentyfikowanej w tym badaniu(dodatkowe rys. 1). Tak więc, jest prawdopodobne, że obecny protokół krystalizacji preferencyjnie krystalizuje endogenny kompleks FH4 współczyszczony w próbkach białka eDHFR, a jego rozpad w krysztale jest nieodwracalny w warunkach, które testowaliśmy, prawdopodobnie z powodu utleniania na skończonym poziomie tlenu. Chociaż szybka naprzód katalityczna reakcja wytwarzania FH4 z FH2 jest termodynamicznie faworyzowana w obecności nadmiaru NADPH jako In vivo, powolny rozpad kompleksu FH4 z powrotem do kompleksu FH2 może wystąpić bez dalszego dostarczania NADPH, jak obserwowaliśmy tutaj w Warunkach krystalizacji in vitro. Tak więc tajemnica, dlaczego długo poszukiwany kompleks FH4 był trudny do uzyskania, ujawnia się jako jego wewnętrzna niestabilność. Jest bardzo prawdopodobne, że kluczem do naszego sukcesu w uzyskaniu chwiejnej chemicznie złożonej struktury FH4 jest terminowe zbieranie dobrze dyfrakujących kryształów w ciągu 2 dni wzrostu w Warunkach krystalizacji określonych tutaj. Ponadto badanie pola DHFR wskazuje, że wiele krystalograficznych19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 i NMR12,13,15,17,19,25,26 badania DHFR stosowane dializy w celu usunięcia endogennych ligandów przed wprowadzeniem egzogennych ligandów zainteresowania. Zidentyfikowaliśmy stan krystalizacji, który izoluje endogenny kompleks DHFR związany z FH4 bez dializy próbki białka lub wprowadzenia dodatkowych substratów lub produktów. Postulujemy, że obecny stan krystalizacji dla kompleksu eDHFR:FH4 sprzyja postaci związanej z FH4 w porównaniu z innymi formami, takimi jak edhfr:FH2:NADP(H) trójskładnikowy.

charakterystyka strukturalna kompleksu eDHFR:FH4

kompleks FH4 przyjmuje zamkniętą konformację w eDHFR (patrz Fig. 4 i 5). Jest to zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, które sugerują, że wszystkie dwu – i trójskładnikowe kompleksy FH4 w stanie podstawowym cyklu katalitycznego (przeniesienie po wodorku i konwersja sp2 do sp3 w C6) występują w zamkniętych konformacjach. Jest to spowodowane sterycznym zderzeniem przechylonego pierścienia pterynowego FH4 z pierścieniem nikotynamidowym NADP (H), które wystąpiłoby w zamkniętej konformacji pętli Met20 (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Jak wskazano na Fig. 4, FH4 ma kontakty van der Waalsa i korzystne polarne interakcje z aktywnymi pozostałościami i wodami. W szczególności, dwa bidentanowe mosty solne z Asp27 i Arg57 zakotwiczają dwa końce FH4, aminopirymidynę (N3 i egzocykliczny-NH2) i α-karboksylan, odpowiednio, w prawie identycznych pozycjach jak w kompleksach substratowo-analogowych12, 20,24,45.

struktura aktywnej strony kompleksu eDHFR: FH4 pokazana w widokach stereo. łańcuch boczny (cyjan) w granicach 4 Å od FH4 (zielony) i pętla Met20 (żółty) są pokazane jako patyki. Struktury wtórne są wyświetlane jako karykatury w kolorze szarym, a wody w granicach 3,5 Å od FH4 jako kule. Polarne interakcje z FH4 są oznaczone przerywanymi liniami. Mapa gęstości elektronów fo–Fc z pominięciem FH4 jest pokazana na poziomie 3,5 σ na czerwono, a Mapa omit 2FO-Fc na poziomie 1,0 σ jest pokazana na niebiesko dla pozostałości i wód. Trzy konformatory powiązań Amidowych Ile14-Gly15 są oznaczone przerywanym kółkiem i czerwonymi strzałkami. B Rozszerzony widok połączenia Ile14-Gly15

superpozycja kompleksu FH4 z kompleksami analogowymi FH2 i FH4. Obecne FH4, FH2 i zgłoszone kompleksy eDHFR oraz zgłoszony kompleks 5-formylo-FH4 wraz z ich zamkniętymi konformacjami pętli Met20, resztami Phe31 i odpowiednimi ligandami są zabarwione odpowiednio na Zielony, magenta i żółty. Wszystkie inne struktury z PDB IDs: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (DDFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20 i 4psy (folian:NADP+)20 są w kolorze szarym. Czerwony przerywany okrąg wskazuje proponowane interakcje π-π pomiędzy Phe31 i ligandami grupy benzoilowe, które przyjmują dwie różne orientacje w zależności od związanych ligandów. FH4 i 5-formylo-FH4 należą do jednego klastra w przeciwieństwie do ddFH4, FH2 i folianu, podczas gdy łańcuchy boczne Phe31 pozostają w prawie tej samej pozycji we wszystkich wyrównanych strukturach. Pętle Met20 są podzielone na trzy ogólne Stany konformacyjne, zamknięte, częściowo zamknięte i okludowane. Tylko konformacje zamknięte mogą strukturalnie pomieścić grupę nikotynamidową kofaktora NADP (H) wchodzącego do miejsca aktywnego

istnieją dwie cząsteczki wody łączące pętlę Met20 i FH4 poprzez sieć wiązania wodorowego, która obejmuje Gly15 (C = O)-wat1-FH4 (N5) i Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Interakcje te są nieobecne w wcześniej zgłaszanych kompleksach (6r)-5,10-dideazatetrahydrofolianu (ddFH4) 12,45 z powodu wymiany N do C w pozycjach 5 i 10 w analogu. Może to spowodować obserwowaną różnicę w konformacji Met20 w analogu w porównaniu do kompleksu FH4 (rys. 5). Jedynymi dostępnymi strukturami w PDB, które bardzo przypominają konformację pętli Met20 w kompleksie FH4, są kompleks 5-formylo-FH4 (Fig. 5, PDB ID: 1JOM)51 i dwa allosteryczne kompleksy hamujące edhfr-nanobody, które celują w różne epitopy DHFR z powinowactwem nanomolarnym(dodatkowe rys. 2, PDB IDs: 3K74 i 4EIG) 28,29. Kompleks 5-formylo-FH4 zachowuje wodę pomostową między Glu17(NH) i FH4(N10), tak jak w kompleksie FH4, pomimo ich różnych grup przestrzennych odpowiednio P61 i P212121. 5-Formylo-FH4, znany również jako kwas folinowy lub leukoworyna, jest zatwierdzonym przez FDA lekiem ratunkowym zapobiegającym szkodliwemu działaniu metotreksatu podczas chemioterapii 53. Grupa γ-karboksylowa FH4 wykazuje niewielką gęstość elektronów (rys. 4), co sugeruje zaburzenia lub większą swobodę rotacji wiązania wokół osi Cß-Cy lub Cy-Cδ niż w innych częściach ligandów.

oprócz sieci wodnej odkryliśmy strukturalne pochodzenie oddziaływań stabilizujących w kompleksie FH4 i powolnym uwalnianiu produktu na podstawie porównania strukturalnego obecnych kompleksów binarnych FH4 i FH2 oraz wcześniej zgłoszonych struktur eDHFR. Po pierwsze, kontakt van der Waalsa z łańcuchem bocznym Glu17 skutkuje dodatkowym zabezpieczeniem FH4 przed rozpuszczalnikiem (rys. 4), który jest nieobecny w substratach lub produktach Analog (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolian complexes12,20,24,45. Po drugie, wyraźna gęstość elektronów trzech alternatywnych konformacji szkieletowych zachowywanego wiązania amidowego Ile14-Gly15 sugeruje entropowy wkład w stabilność kompleksu FH4 z lokalnej elastyczności przy kotwicy pętli Met20 (Fig. 4). W szczególności, poprzednie badania mutagenezy wykazały, że Ile14 ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania elastyczności pętli Met20, podczas gdy warianty i14v, I14A i i14g wykazały wolniejszą szybkość transferu wodorków, większą elastyczność pętli Met20, obserwowaną w otwartej konformacji w strukturach krystalicznych, zwiększoną zależność od temperatury pierwotnego kinetycznego efektu izotopowego i wyższą energię aktywacji stanu przejściowego obliczoną na podstawie hybrydowych symulacji QM/MM23,40. Po trzecie, obrót pierścienia benzoilowego prowadzi do elektrostatycznie korzystnych oddziaływań od krawędzi do twarzy π-π z zachowanym Phe31 w kompleksie FH4, w przeciwieństwie do oddziaływań odpychających proton-Bliski proton (od krawędzi do krawędzi) w kompleksach FH2, kwasu foliowego i ddFH4, niezależnie od wiązania NADP(H) (Fig. 5, widok rozszerzony, rys. 6)54,55. Funkcjonalna implikacja tej zmiany strukturalnej jest również wspierana przez obserwację jednoczesnego obrotu pierścienia benzoilowego i przejścia sp3 do sp2 w pozycji C6 związanego ligandu w czasie rozpadu FH4 do FH2 w kompleksie (Fig. 3). Rola Phe31 w kontrolowaniu uwalniania produktu została dodatkowo potwierdzona w poprzednich badaniach mutagenezy56, w których wykazano, że warianty f31v i f31y eDHFR wykazywały dwukrotne zwiększenie stałej szybkości w stanie stacjonarnym kcat i szacowany 20-do 50-krotny wzrost szybkości uwalniania produktu oprócz wpływu mutacji na spowolnienie transferu wodorków.

oddziaływania elektrostatyczne układów π-π. Szczegóły w refs 54,55

biorąc pod uwagę dynamiczne właściwości konkretnego systemu DHFR E. coli, obserwowany tutaj stabilny okludowany kompleks eDHFR:FH4 (półprodukt o niskiej energii swobodnej w jego dynamicznym krajobrazie) może uzasadnić powolną kinetykę uwalniania produktu (szybkość dysocjacji FH4 Koffa, etap ograniczający szybkość cyklu katalitycznego eDHFR). Zgodnie z wcześniejszymi badaniami dyspersji relaksacyjnej NMR, każdy etap cyklu katalitycznego DHFR E. coli następuje raczej po” selekcji konformacyjnej „niż mechanizmie” indukowanego dopasowania ” 15. W związku z tym, mikroskopijna szybkość każdego kroku wzdłuż współrzędnych reakcji zależy od konformacyjnej szybkości pobierania próbek enzymu15 (np. stanu przejściowego właściwego dla szybkiego transferu wodorku lub ograniczającego szybkość uwalniania produktu). Oznacza to, że im bardziej stabilny jest stan podstawowy i im bardziej różni się on od wzbudzonego stanu podrzędnego, tym większy jest koszt darmowej energii wymagany do próbkowania takich konformacji. W przypadku eDHFR będzie to wiązało się z reorganizacją aktywnej lokalizacji i elastyczną pętlą Met20. W badaniach dyspersji relaksacyjnej NMR eDHFR15 zaproponowano, że subpopulowany stan wzbudzony dla etapu chemicznego transferu wodorków przyjmuje konformację zamkniętą (której kompleks Michaelisa w stanie podstawowym znajduje się w konformacji zamkniętej). Jednakże subpopulowany stan wzbudzony dla etapu uwalniania produktu przyjmuje konformację zamkniętą (której kompleks FH4 w stanie podstawowym znajduje się w konformacji zamkniętej). Wzdłuż współrzędnych reakcji, obecnie obserwowany kompleks binarny eDHFR: FH4 znajduje się pomiędzy kompleksami pośrednimi eDHFR:FH4:NADP+ i edhfr:FH4:NADPH (Fig. 1). Obie przyjmują zakomponowane konformacje, w których Grupa nikotynamidowa kofaktora jest oddalona od miejsca aktywnego15. Aby pobrać próbkę „zamkniętego wzbudzonego stanu podrzędnego” podczas ograniczającego szybkość uwalniania produktu 15, musi nastąpić reorganizacja miejsca aktywnego z zamkniętego stanu podstawowego. Jest to reprezentowane przez stabilny katalityczny związek pośredni eDHFR: FH4 uchwycony w tym badaniu. Współczynnik dysocjacji produktu koff FH4 był zwiększony po wiązaniu kofaktora z dwukrotnym wzrostem dla eDHFR: FH4: NADP+ w porównaniu do eDHFR:FH4 i ośmiokrotnym wzrostem dla eDHFR:FH4:NADPH w porównaniu do eDHFR:FH4 mierzone zarówno przy pH 6, jak i pH 9 przez eksperymenty konkurencji35. Oznacza to przyspieszone uwalnianie produktu i zwiększoną częstotliwość próbkowania konformacyjnego, gdy kofaktor jest związany. Chociaż autentyczna struktura trójskładnikowego kompleksu Stanów podstawowych eDHFR:FH4:NADPH nigdy wcześniej nie została zgłoszona, stawiamy hipotezę, że może istnieć znaczące podobieństwo do kompleksu binarnego eDHFR: FH4, ponieważ wszystkie ziemskie Stany pośrednie związane z FH4 przyjmują zamkniętą konformację15. Spodziewamy się jednak, że Wiązanie kofaktorów zwiększy populację podstacji wzbudzonych, zaproponowanych wcześniej w oparciu o badania dyspersji relaksacyjnej NMR w konformacji zamkniętej15. Zgodnie z tym, zaobserwowaliśmy, że w trójskładnikowym kompleksie struktury eDHFR:FH2:NADP(H) (również określonym w naszym badaniu w oddzielnych warunkach krystalizacji), pętla Met20 stała się nieuporządkowana. Sugeruje to ogólny mechanizm kofaktora ułatwiający wymianę ligandów poprzez zwiększenie częstości próbkowania konformacyjnego, gdy kofaktor jest związany z ugrupowaniem nikotynamidowym skierowanym z dala od miejsca aktywnego.

w kompleksie FH4 odległość między pierścieniem benzoilowym FH4 (C1ʹ) a Phe31 (Cz) wynosi 4,93 Å, co jest znacznie krótsze o (~0,3-0,6 Å) niż odpowiednie odległości w obecnych FH2 i wcześniej zgłoszonych kompleksach FH2 (PDB ID: 1RF7, 4PDJ)20,24, które wynoszą odpowiednio 5,22, 5,55 i 5,32 Å. Podobny trend skracania odległości wzdłuż współrzędnych reakcji eDHFR podkreślono w dwóch niezależnych badaniach obliczeniowych. W badaniu QM / MM obliczono, że odpowiednia odległość jest skrócona o ~0,3 Å od kompleksu Michaelisa do stanu przejściowego w miarę wystąpienia reakcji transferu wodorku i że różnica w tej odległości (~0,01 Å) między stanem przejściowym a produktem reakcji27. Inne badania wykorzystujące mieszaną kwantową / klasyczną dynamikę molekularną sugerowały bardziej dramatyczne skrócenie odpowiedniej odległości o ~1 Å, gdy reakcja ewoluuje od reagenta do stanu przejściowego18. Dlatego nasze obserwacje krystalograficzne są w ogólnej zgodzie z wcześniejszym modelowaniem obliczeniowym sugerującym, że do pewnego stopnia kompleks FH4 zachowuje fizyczny charakter stanu przejściowego. Jest to również zgodne z wcześniejszymi obserwacjami na temat dynamicznego krajobrazu energetycznego eDHFR odwzorowanego przez dyspersję relaksacyjną NMR, że każdy związek pośredni w cyklu katalitycznym pobiera nisko leżące Stany wzbudzone, których konformacje przypominają struktury stanu podstawowego poprzednich lub następnych półproduktów 15. Ponieważ enzymy stabilizują stan przejściowy, powolne uwalnianie produktu rodziny DHFR można przypisać przeniesieniu fizycznej natury stanu przejściowego na kompleks produktu reakcji. Wynika to z ustalonego tu od dawna kompleksu FH4, oprócz specyficznych dla gatunku zmian konformacyjnych wymaganych podczas cyklu katalitycznego32.

charakterystyka okludowanego kompleksu eDHFR z powinowactwem wiązania nanomolarnego inhibitora o powolnym początku

krystalografia rentgenowska pokazuje, że kompleks eDHFR z inhibitorem o powolnym początku AMPQD46 również wykazuje okludowaną konformację. Pętla Met20 przyjęła konformację w kompleksie AMPQD, która przypomina kompleks trójskładnikowy z przeciwcukrzycowym biguanidem fenforminy i NADP+ (PDB ID: 5UIH) 52. Z drugiej strony, zatwierdzony przez FDA środek chemioterapeutyczny metotreksat był wcześniej wykazywany za pomocą krystalografii Rentgenowej24,47, NMR48 i kinetyki jednocząsteczkowej49, aby wiązać się w zamkniętej konformacji DHFR (Fig. 7). Ta rozbieżność w konformacjach białek była nieoczekiwana, ponieważ wszystkie trzy inhibitory mają wspólną cechę strukturalną: grupę biguanidową fenforminy, grupę diaminopirymidynową AMPQD i grupę diaminopterynową metotreksatu, z których każdy jest połączony z grupą fenylową za pomocą elastycznego łącznika. Jednak dokładne badanie nad strukturalną superpozycją odpowiednich kompleksów inhibitorów eDHFR (Fig. 7) wykazał, że grupa wiązania metyloamino metotreksatu (nieobecna w fenforminie i AMPQD) zajmowała pozycję, która powodowałaby potencjalne steryczne zderzenie z pętlą Met20, gdyby przyjęła zamkniętą konformację, jak w kompleksach fenforminy i AMPQD. Wcześniej wykazaliśmy, że AMPQD wykazywał stosunkowo większą preferencję (trzykrotne zmniejszenie IC-50 I Ki) do hamowania eDHFR w porównaniu z ludzkim DHFR46. Jeszcze większa swoistość gatunkowa dla E. coli nad ludzkim DHFR (~30-krotnie) obserwuje się dla związku macierzystego AMPQD, który nie ma aminofenylowej grupy ogonowej i łącznika metylenowego46. Obecna struktura krystaliczna okludowanego kompleksu eDHFR z AMPQD dostarcza wiarygodnego mechanistycznego wyjaśnienia jego specyficzności gatunkowej, przypisanej różnicami w równowadze konformacyjnej ludzkiego DHFR vs. eDHFR. Pierwszy jest obserwowany wyłącznie w konformacjach zamkniętych, podczas gdy drugi wykazuje wyższą elastyczność konformacyjną zarówno w konformacjach zamkniętych, jak i okludowanych, jak omówiono dalej.

struktura kompleksu hamującego eDHFR: AMPQD. Stereofoniczny widok interakcji miejsca aktywnego z AMPQD z mapą pominięcia Fo-Fc na poziomie 3,5 σ. Łańcuchy boczne białek (cyjan) w obrębie 4 Å od AMPQD (zielony) są pokazane jako pałeczki, w tym dwie reszty z pętli Met20 (żółty). Oddziaływania biegunowe są oznaczone liniami przerywanymi. B superpozycja AMPQD (zielony), fenforminy (żółty, PDB: 5UIH)52 i kompleksów metotreksatu (szary pokazany jako cienkie pałeczki z PDB: 1RA3, 1DDS) 20,47. Pętle Met20 są pokazane jako karykatury, a ligandy jako kije. Struktury chemiczne ligandów są rysowane na górze. NADP (H) nie jest wyświetlany w żadnej ze struktur dla ułatwienia oglądania

porównanie konformacji DHFR w oparciu o klastrowanie

klastrowanie struktur PDB DHFR przy użyciu RMSD atomów szkieletu pętli Met20 ca jako metryki odległości (rys. 8 i dodatkowe rys. 3) wskazuje, że ludzki DHFR przyjmuje wyłącznie konformację zamkniętą (katalitycznie właściwy dla wiązania NADPH), podczas gdy eDHFR jest znacznie bardziej elastyczny zarówno z konformacjami zamkniętymi, jak i zamkniętymi. Okludowane konformacje występują rzadziej (17%) w strukturach eDHFR. Zarówno kompleks uwalniania produktu ograniczającego szybkość z FH4, jak i Kompleks hamujący o powolnym początku z AMPQD przyjmują zamkniętą konformację eDHFR (Fig. 9), który jest rzadko reprezentowany w PDB (dodatkowe rys. 3). Co ciekawe, zarówno FH4,jak i AMPQD dzielą cechy powinowactwa nanomolarnego i powolnego uwalniania z eDHFR35,36, 46 z pozycją kluczowych atomów azotu na heterocyklach silnie zachowanych, a różnice widoczne są w ogonach. Sugeruje to nową strategię rozwoju inhibitorów DHFR poprzez ukierunkowanie na okludne konformacje eDHFR. Proponujemy również strategię zwalczania oporności na leki. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym. 4, porównując konformację AMPQD do FH4 i trimetoprim do FH4, istnieją subtelne różnice w kopertach van der Waalsa. Trimetoprimowe warianty ucieczki eDHFR E. coli DHFR posiadają mutacje, które również blokują hamującą funkcję AMPQD57. Badając różnice w interakcjach, można szukać innych ligandów, które minimalizują te różnice interakcji z FH2 i FH4. Może to zapewnić, że mutacje, które zmniejszają Wiązanie inhibitorów, zmniejszą również powinowactwo wiązania FH2 i FH4.

grupowanie 162 struktur DHFR opartych na ich parach Ca rmsd pętli Met20. Struktury DHFR są reprezentowane przez koła wypełnione niebieskim (ludzie), zielonym (eDHFR) i czerwonym (w tym badaniu). Długość krawędzi (odpowiednio w Kolorze Fioletowym dla konformacji zamkniętej i złotym dla konformacji zamkniętej) jest proporcjonalna do maksimum RMSD konformatorów pętli Met20. Bardziej szczegółowy schemat grupowania znajduje się w informacjach uzupełniających

superpozycja kompleksów AMPQD (zielony) i FH4 (żółty). Pętle Met20 są pokazane jako karykatury, a ligandy jako kije. Widok po prawej stronie jest obracany o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół osi pionowej z perspektywy pokazanej po lewej stronie

charakterystyka trójskładnikowego kompleksu eDHFR

wreszcie, w eDHFR: FH2:Trójskładnikowy kompleks NADP (H) Z jednocześnie oczyszczonym endogennym ligandem i kofaktorami (Fig. 10), odkryliśmy, że pętla Met20 staje się nieuporządkowana. Wspiera to rolę wiązania kofaktora w zwiększaniu pobierania próbek konformacyjnych w celu szybkiej wymiany ligandów lub ułatwianiu uwalniania produktu za pomocą mechanizmu allosterycznego (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. Grupa rybozy nikotynamidowej odchyla się od miejsca aktywnego (rys. 10) podobny do zamkniętego kompleksu trójskładnikowego FH412. Jego stan redoks jest Nieznany na podstawie gęstości elektronów. Zdolność do izolowania różnych endogennych wiązanych ligandami, binarnych i trójskładnikowych kompleksów eDHFR w różnych warunkach krystalizacji sugeruje, że eDHFR zawiera mieszaninę gatunków molekularnych z różnymi wiązanymi ligandami i zespołem konformacji. Skuteczność zastosowanego tu podejścia krystalograficznego wykorzystuje niejednorodność molekularną, pomijając etap dializy w celu wyizolowania długo trwającej i chwiejnej chemicznie złożonej struktury krystalicznej FH4. Jest to przeciwieństwem typowego procesu polegającego na wstępnej obróbce próbek DHFR przez dializę, która usuwa śladowe endogenne ligandy i zwiększa jednorodność próbki. Ulepszona jednorodność ogólnie poprawia ogólny wskaźnik sukcesu eksperymentów koekrystalizacji lub moczenia kryształów, gdy interesujące ligandy są egzogennie wprowadzane.

Stereofoniczne widoki trójskładnikowego kompleksu DHFR:FH2:NADP (H). Nieuporządkowana pętla Met20 (pozostałości między Ile14 i Pro21) jest oznaczona jako czarne linie przerywane. Mapa pominięcia Fo-Fc na poziomie 3,0 σ jest pokazana jako czerwona siatka. Struktury wtórne są pokazane jako karykatury i ligandy w reprezentacji kija. Atomy są zabarwione w następujący sposób: węgiel (biały), azot( niebieski), tlen (czerwony) i fosfor (pomarańczowy)