Timeless TCID50: jedno rozwiązanie dla wielu wirusów
w tym miesiącu omówimy stary klasyczny test TCID50 w dawce zakaźnej hodowli tkankowej. Test TCID50 stosuje się do ilościowego oznaczania miana wirusa poprzez określenie stężenia, przy którym 50% zakażonych komórek wykazuje działanie cytopatyczne (CPE). Tak długo, jak interesujący wirus powoduje śmierć komórki, test ten ma tę zaletę, że jest tani i łatwy do wdrożenia również wtedy, gdy przeciwciała specyficzne dla wirusa nie są dostępne. W rzeczywistości bardzo mało informacji na temat samego wirusa jest wymagane, co czyni go kluczowym narzędziem do badania nowych i pojawiających się patogenów.
test TCID50: co to jest i jak go używać
w teście TCID50 seryjne rozcieńczenia wirusa są dodawane do monowarstw komórek i pozostawiane do momentu, gdy będzie można zobaczyć CPE. W tym momencie wpływ seryjnego rozcieńczenia na komórki można oceniać w sposób nieciągły lub ciągły. W sposób nieciągły, pojedyncze rozcieńczenie, przy którym 50% komórek wykazuje CPE, stosuje się do przybliżonego określenia ilościowego ilości wirusa obecnego w oryginalnym składzie. Jest to dość proste i nie wymaga dalszej analizy. Jednak ma również pewien stopień niedokładności, ponieważ nie pozwala dokładnie rozróżnić w tym samym rozcieńczeniu.
dokładniejsze informacje można uzyskać w sposób ciągły za pomocą odczytu kolorymetrycznego, np. substrat metaboliczny o specyficznej absorbancji, gdzie ilość pozyskanego sygnału jest proporcjonalna do liczby żywych komórek. Wartości absorbancji różnych rozcieńczeń można następnie wykreślić w ciągłej krzywej regresji nieliniowej dawka-odpowiedź, z której możliwe będzie ekstrapolowanie dokładniejszych wartości TC50. Metoda nieciągła jest wystarczająca, jeśli dokładne miano nie jest wymagane lub w celu określenia, jakie stężenie wirusa jest potrzebne do uzyskania pewnego odsetka infekcji w dalszych testach (zaletą TCID50 jest to, że można ją wykonać na interesującej linii komórkowej, o ile wirus powoduje CPE). Jednak nawet w tych przypadkach może być lepiej użyć rozcieńczenia fałdy między 1: 2 i 1: 5 w celu poprawy dokładności. Jeżeli zamiast tego konieczne jest dokładniejsze oznaczanie ilościowe, na przykład przy porównywaniu wpływu różnych metod leczenia lub mutacji na miana wirusa, preferowana może być metoda kolorymetryczna.
od rozcieńczeń DO MIAN
wartości TCID50 wskazują, ile wirusów jest potrzebnych do uzyskania CPE w 50% komórek. Ale jak przejść od tego do rzeczywistej ilości wirusa na ml? Wzór jest dość prosty i polega na pomnożeniu wartości TCID50 przez 0,7. Wynika to z rozkładu Poissona zastosowanego do infekcji wirusowej, który stwierdza, że w całkowicie permisywnej linii komórkowej prawdopodobieństwo osiągnięcia 50% infekcji jest osiągane przez wielokrotność infekcji około 0,7. Nie zawsze jest to prawda, ale jest to dobre przybliżenie dla większości aplikacji.
problemy z liczeniem wirusów
jak najdokładniej można, zliczanie wirusów nigdy nie jest łatwe. Po pierwsze, szeregowe rozcieńczenia są – ze swej natury-źródłem błędów. Po drugie – co jest szczególnie istotne w przypadku wysokich mian wirusa-nawet najmniejsza objętość, która pozostaje przymocowana do samego końca końcówki pipety, może przenosić wystarczająco dużo cząstek wirusa, aby znacząco zmienić oznaczenie ilościowe. Po trzecie, biologiczna zmienność systemu jest wysoka. Płytka ta sama ilość komórek, dodać taką samą ilość wirusa, zatrzymać infekcję w tym samym czasie, a procent infekcji może być blisko, ale nigdy dokładnie taki sam.
wreszcie, oceniając leczenie, które (jak można mieć nadzieję!) zmniejsza miano wirusa, ilość wirusa może spaść poniżej progu wykrywalności testu.
Sztuka liczenia wirusów
dobra wiadomość jest taka, że gdy już poznasz swoje problemy, nie jesteś daleko od rozwiązania! Dokładność rozcieńczania szeregowego można zmniejszyć dzięki automatyzacji, ale nawet jeśli nie jest to dostępne, niektóre małe wskazówki mogą mieć znaczenie. Obejmują one wymianę końcówek pipety i nigdy nie wkładać końcówki pipety głębiej niż milimetr do następnego rozcieńczenia, aby uniknąć przypadkowego przenoszenia dodatkowych kłód wirusa, który właśnie utknął na zewnętrznym plastiku. Ważne są również replikacje, tym bardziej w przypadku testów zminiaturyzowanych. Płytki 96 dobrze umożliwiają jednoczesną obsługę wielu próbek w sposób, że bardziej metody o niskiej przepustowości (jak test płytki nazębnej) nie pozwoli, ale pochodzą one z dodatkową zmienność, jak małe objętości są jeszcze bardziej wrażliwe na kwestie omówione powyżej. Podczas gdy techniczne replikaty idą w jakiś sposób, aby rozwiązać ten problem, w VRS staramy się przeprowadzać eksperymenty, które będą wymagały kolorymetrycznego TCID50 w trzech egzemplarzach biologicznych. Zwiększa to solidność podejścia i pozwala wykluczyć fałszywe punkty w zbiorze danych bez utraty znaczenia. Dokładne wartości TC50 będą wymagały nieliniowej odpowiedzi dawki regresji danych kolorymetrycznych, które programy takie jak GraphPad Prism mogą łatwo wygenerować. Jednak zdolność dowolnego oprogramowania do wykreślania tego rodzaju krzywej będzie ściśle zależeć od jakości danych i bliskich wartości liczbowych replikatów. Wizualna kontrola krzywych i wygenerowanych wartości TC50 jest wysoce zalecana w celu skorygowania sytuacji, w których ekstrapolacja została wypaczona przez fałszywe punkty danych. Przede wszystkim, nasze doświadczenie sugeruje, że poza standardowymi miareczkowaniem zapasów wirusów, eksperymenty, które będą wymagały odczytu TCID50, mogą wymagać dodatkowych kroków optymalizacji, zarówno w celu określenia najlepszych warunków biologicznych, które zapewnią pobranie odtwarzalnych ilości wirusa (np. wybór linii komórkowej, format płytki, mnogość infekcji, punkty czasowe) i najlepszy zakres stężeń do badania w teście TCID50 (np. początkowe stężenie i fałd rozcieńczenia).
śmierć komórki czy ładne zdjęcia?
liczenie martwych komórek nie jest łatwe, ponieważ bardzo często porzucają one talerz przy pierwszym praniu-podobno wciąż tam są! To nie pomaga w dokładności. Chociaż droższe i pracochłonne, gdy dobre przeciwciało jest dostępne, barwienie immunofluorescencyjne jest podejściem, które zwykle wybieramy. Test można przerwać przed śmiercią komórki, a czułość jest na ogół wyższa, co pozwala na większą kontrolę i większą dokładność. Dodatkowo, ta metoda może być stosowana w przypadku wirusów, które nie powodują CPE, lub które zajmują dużo czasu, aby to zrobić (i spójrzmy prawdzie w oczy, niektóre ładne zdjęcia wirusa w działaniu są znacznie bardziej podnoszące na duchu!). Uszkodzenie komórek jest jednak znakiem rozpoznawczym większości infekcji i kilku pojawiających się wirusów, o których wiemy bardzo mało. Obecnie dostępnych jest kilka reporterów kolorymetrycznych / fluorescencyjnych do wrażliwego pomiaru i rozróżniania różnych rodzajów cytotoksyczności. Wygląda na to, że ten stary klasyk jest gotowy na nowe wyzwania!