test ELISA daje trzy różne rodzaje danych wyjściowych:
ilościowe
dane ELISA można interpretować w porównaniu ze standardową krzywą (seryjne rozcieńczenie znanego, oczyszczonego antygenu) w celu precyzyjnego obliczenia stężenia antygenu w różnych próbkach (Fig.6).
jakościowa
Elisa może być również wykorzystana do uzyskania odpowiedzi Tak lub nie, wskazującej, czy dany antygen jest obecny w próbce, w porównaniu z ślepą studnią niezawierającą antygenu lub niepowiązanym antygenem kontrolnym.
Półilościowe
ELISA można wykorzystać do porównania względnych poziomów antygenu w próbkach badanych, ponieważ intensywność sygnału będzie się różnić bezpośrednio ze stężeniem antygenu.
Standardowa krzywa
dane ELISA są zwykle wykresowane gęstością optyczną w porównaniu ze stężeniem logarytmicznym, aby uzyskać krzywą sigmoidalną, jak pokazano na fig.6. Znane stężenia antygenu są wykorzystywane do wytworzenia krzywej standardowej, a następnie dane te są wykorzystywane do pomiaru stężenia nieznanych próbek w porównaniu z liniową częścią krzywej standardowej. Można to zrobić bezpośrednio na wykresie lub za pomocą oprogramowania do dopasowywania krzywych, które zwykle znajduje się na czytnikach płyt ELISA.
6. Typowa krzywa ELISA.
modele krzywej kalibracji
jeśli potrzebny jest wynik ilościowy, najprostszym sposobem postępowania jest uśrednianie trzykrotności odczytów wzorców i odjęcie odczytu ślepej próbki kontrolnej. Następnie narysuj krzywą standardową, znajdź linię najlepiej dopasowaną lub przynajmniej narysuj krzywą punkt-punkt, aby można było określić stężenie próbek. Wszelkie rozcieńczenia należy dostosować na tym etapie. Jest to na ogół praktyczny zakres, w jakim można wykonywać obliczenia ręczne.
odmianą jest wykreślanie danych za pomocą semi-log, log / log, log / logit i jego pochodnych – 4 lub 5 parametrów modeli logistycznych. Korzystanie z rozwiązań opartych na oprogramowaniu/zautomatyzowanych umożliwia rozważenie bardziej wyrafinowanych podejść do tworzenia wykresów. Korzystanie z regresji liniowej w pakiecie oprogramowania dodaje kilka dodatkowych możliwości sprawdzania; możliwe jest sprawdzenie wartości R2 w celu określenia ogólnej dobroci dopasowania. Dla tej części krzywej, gdzie zależność stężenia od odczytu ma zależność liniową, wartości R2 >0,99 stanowią bardzo dobre dopasowanie. Dokładność można następnie jeszcze bardziej zwiększyć poprzez zastosowanie dalszych standardowych stężeń w tym zakresie.
jednym z aspektów wykresu liniowego jest to, że kompresuje on punkty danych na niższych stężeniach krzywej standardowej, dzięki czemu jest to najbardziej dokładny zakres (obszar najbardziej prawdopodobny do osiągnięcia wymaganej wartości R2). Aby przeciwdziałać tej kompresji można użyć wykresu semi-log; tutaj log wartości stężenia (na osi x) jest wykreślany względem odczytu (na osi y). Ta metoda daje krzywą danych w kształcie litery S, która rozkłada więcej punktów danych na bardziej przyjazny dla użytkownika wzór sigmoidalny.
typ wykresu log/log (log koncentracji względem log odczytu) umożliwia linearyzację większej części krzywej danych. Niski do średniego standardowy zakres stężeń jest na ogół liniowy w tym modelu, tylko wyższy koniec zakresu ma tendencję do nachylenia. Log / logit i jego pochodne, modele logistyczne 4 lub 5 parametrów, są bardziej wyrafinowane i wymagają bardziej złożonych obliczeń i estymacji wartości max, min, EC50 i slope. Model 5 parametrów dodatkowo wymaga wartości asymetrii.
chociaż te modele krzywej kalibracji mogą zapewnić lepszą wydajność, dobrym punktem wyjścia byłoby wykorzystanie wykresu log-log z kontrolą procentu odzysku (odzysk analitu z próbek z kolcami). Alternatywnie, co najmniej „dopasowanie” standardowych wartości odczytu krzywej jest często „wystarczająco dobrym” podejściem. Najprostszym sposobem sprawdzenia jest wcześniejsze obliczenie wzorców kalibracji i sprawdzenie, czy mieszczą się one w granicach 20% nominalnej wartości odczytu. Jedno zastrzeżenie to nie polegać na „dobrych” wartościach R2 i znaleźć model krzywej kalibracji, który zapewnia najlepsze wartości odzysku dla norm.
czułość ELISA
Elisa są jednym z najbardziej wrażliwych dostępnych testów immunologicznych. Typowy zakres detekcji dla testu ELISA wynosi 0,1 do 1 fmole lub 0,01 ng do 0,1 ng, z czułością zależną od szczególnych cech interakcji przeciwciało-antygen. Ponadto niektóre substraty, takie jak te dające wzmocniony sygnał chemiluminescencyjny lub fluorescencyjny, mogą być używane do poprawy wyników.
jak wspomniano wcześniej, Detekcja pośrednia wytworzy wyższy poziom sygnału i dlatego powinna być bardziej wrażliwa. Jednak może również powodować wyższy sygnał tła, zmniejszając w ten sposób poziomy sygnału specyficznego dla sieci.