rozwój i stopniowe ulepszenia drożdżowego systemu dwóch hybryd (Y2H)od początku lat 90-tych zrewolucjonizowały sposób wykrywania interakcji białkowych1.
drożdże dwu-hybrydowe opierają się na odtworzeniu czynnościowego czynnika transkrypcyjnego (TF), gdy dwa białka lub interesujące polipeptydy wchodzą w interakcję. Ma to miejsce w genetycznie zmodyfikowanych szczepach drożdży, w których transkrypcja genu reporterowego prowadzi do określonego fenotypu, Zwykle wzrostu na podłożu selektywnym lub zmiany koloru Kolonii drożdży. Najbardziej popularnymi genami reporterowymi są HIS3, aby wybrać drożdże na pożywce pozbawionej histydyny, i LacZ do przesiewania drożdży w teście kolorymetrycznym.
szczegóły techniczne testu dwóch hybryd drożdży przedstawiono w poniższym rysunku.
pomiędzy każdym badanym białkiem a domeną wiążącą DNA (DBD) lub domeną aktywacyjną (AD) TF powstają dwie Fuzje („hybrydy”). Białko połączone z DBD jest określane jako „przynęta”, a białko połączone z reklamą jako „zdobycz”.
po interakcji między przynętą a ofiarą, DBD I AD są zbliżone do siebie, a funkcjonalny TF jest odtwarzany przed genem reporterowym. Najpopularniejsze Fuzje wykorzystują DBD i AD drożdży TF Gal4. Bakteryjne białko LexA jest również często używane jako DBD w połączeniu z Gal4 AD.
jako technika genetyczna, dwu-Hybrydowy ekran drożdży oferuje wrażliwy i opłacalny środek do testowania bezpośredniej interakcji między dwoma białkami docelowymi lub do wykorzystania ulubionego białka jako przynęty do przesiewania bibliotek fragmentów białek przygotowanych z pożądanych typów komórek, tkanek lub całych organizmów. Tożsamość współpracujących ze sobą partnerów uzyskuje się następnie poprzez sekwencjonowanie odpowiednich plazmidów w wybranych koloniach drożdży. Zbiory pełnowymiarowych białek („Orfeomów”) stają się również dostępne dla kilku gatunków, ale nie obejmują one jeszcze całego proteomu.
drożdżowy system Dwujęzyczny został szybko przyjęty przez środowisko naukowe, a badania w różnych gatunkach i dziedzinach badawczych doprowadziły już do kilkudziesięciu tysięcy publikacji. Pozostaje to metodą z wyboru, jeśli chodzi o odkrywanie nowych interakcji z białkami, czego odzwierciedleniem jest niedawno opublikowana Literatura.
wariacje Y2H opracowano w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w obecności współczynnika lub enzymu wymaganego do danej modyfikacji potranslacyjnej partnerów białkowych2.
inne wersje pozwalają na przesiewanie integralnych protein błonowych3, a technikę dostosowano do wykrywania interakcji białko-białko w komórkach ssaków 4. Wreszcie, opracowano również protokoły N-hybrydowe drożdży w celu przesiewania nowych interakcji DNA-protein5, RNA-protein6 i małych cząsteczek-białek7.
Odkryj Hybrigenics najnowsza zoptymalizowana usługa dwóch hybrydowych ekranów drożdży: ULTImate Y2H.
skontaktuj się z naszym zespołem naukowców, aby uzyskać bezpłatne porady dotyczące Twojego projektu.
1. Fields, S. and Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. and Arpin, M. Spatial recruitment and activation of the Fes kinase by ezrin promates HGF-induced cell scattering (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. and te Heesen, S. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. and Tavernier, J. Design and application of a cytokine-receptor-based interaction trap (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, J. J. and Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system (1993) Nauka 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. i Kuhl, D. A tri-hybrid system for the analysis and detection of RNA — protein interactions (1996) Nucleic Acids Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. and Liu, J. O. A three-hybrid system for detecting small ligand-protein
receptor interactions(1996) PNAS 93 (23), 12817-12821