5.3 reglarea mediată de miARN a țintelor
în cadrul RISC, miARN interacționează cu genele țintă prin asocierea bazelor. Interacțiunea dintre un miARN și ARNm-ul său țintă este limitată la capătul 5′ al miARN. Complementaritatea secvenței între nucleotidele 2-8, cunoscută și sub numele de „regiunea semințelor”, este vitală pentru recunoașterea secvenței țintă, deși au fost demonstrate excepții de la această regulă . Cel mai frecvent, situsurile de legare miARN sunt prezente în regiunea 3′-netradusă (UTR) a ARNm țintă, de obicei în mai multe copii . Cu toate acestea, miARN s-a demonstrat, de asemenea, că vizează regiunile 5′ – UTR și codificare ale ARNm . Un studiu realizat de Tay și colab. a demonstrat că o rețea de miARN se poate lega de mai multe site-uri în cadrul codificării și 3′-UTR a unei singure ținte ARNm, adăugând la complexitatea reglării țintei mediate de miARN . Gradul de complementaritate dintre regiunea de semințe a miARN și situl de legare din ARNm țintă determină mecanismul prin care miARN reglează ținta . Dacă miARN dezvăluie suficientă complementaritate a secvenței (aproape perfectă) cu ARNm țintă, atunci reglarea este efectuată printr-un proces numit interferență ARN, prin care RISC este direcționat pentru a scinda ARNm țintă . Dacă există o complementaritate insuficientă , care este în general cazul mamiferelor, reglementarea se realizează prin reprimarea traducerii și/sau destabilizarea ARNm .
componentele de bază ale RISC sunt Argonautul (în urmă) familie de proteine, care joacă un rol cheie în funcția sa . Toate cele patru proteine de mamifere din urmă (Ago1–Ago4) pot direcționa represiunea translațională a unui ARNm țintă, cu toate acestea, numai Ago2 posedă activitate „slicer” și este responsabil pentru scindarea ARNm țintă . Mecanismul(mecanismele) exact (e) de represiune translațională mediată de miARN a genelor țintă este încă incert . Mai multe studii au furnizat dovezi că represiunea translațională are loc înainte de inițierea traducerii . Cu toate acestea, alte studii sugerează că represiunea are loc după inițierea traducerii . S-a crezut inițial că reprimarea mediată de miARN a genelor țintă a fost reflectată predominant la nivelul proteinei, fără efect sau minim asupra nivelurilor de ARNm. Cu toate acestea, s-a demonstrat acum că reprimarea mediată de miARN a genelor țintă este frecvent asociată cu destabilizarea ARNm, deși nu se știe dacă acesta este un efect secundar al represiunii translaționale. degradarea mediată de miARN a țintelor ARNm implică deadenilarea (îndepărtarea cozii Poli A), urmată de decapare și digestie exonucleolitică . În plus, organismele de procesare (corpurile P), structurile citoplasmatice implicate în depozitarea și degradarea ARNm, se consideră, de asemenea, că joacă un rol în reglarea miARN . se crede că miARN ghidează ARNm țintă și proteinele RISC asociate acestor structuri de stocare, care sunt îmbogățite pentru degradarea ARNm și factorii de represiune translațională . Mecanismele care dictează dacă un ARNm țintă urmează calea de degradare sau de represiune translațională sunt în prezent necunoscute. La complexitatea reglementării mediate de miARN se adaugă descoperirile recente că, în diferite condiții de stres, reprimarea țintelor indusă de miARN poate fi inversată și că miARN poate activa traducerea ARNm țintă .
reglementarea mediată de miARN pare a fi un proces extrem de dinamic, complexitatea sa fiind sporită de faptul că nu este necesară o complimentaritate perfectă față de țintă pentru Reglementare. Acest lucru indică faptul că un singur miARN are potențialul de a regla mai multe gene țintă. În plus, o rețea de miARN poate funcționa simultan pentru a regla un singur ARNm. Acest lucru face în cele din urmă identificarea in silico a genelor țintă și elucidarea funcției miARN mult mai dificilă.
regiunea de semințe, situată la pozițiile 2-7 de la capătul 5′ al miARN, este utilizată de RISC ca semnal de nucleație pentru recunoașterea ARNm țintă . Pe ARNm siturile corespunzătoare sunt denumite „situri de semințe”. Există o serie de stringențe asociate cu recunoașterea și legarea site-ului semințelor țintă . Un site de semințe stricte are perfectă Watson-Crick obligatoriu și pot fi împărțite în patru tipuri de „semințe”: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1, și 6mer . Fiecare dintre aceste tipuri diferă în funcție de combinația nucleotidei poziției 1 și de asocierea la poziția 8. 8mer are atât o adenină în poziția 1 a site-ului țintă ARNm, cât și asocierea bazei în poziția 8. O adenină pe site-ul țintă corespunzătoare poziției 1 a unui miARN este cunoscută pentru a crește eficiența recunoașterii țintei . 7mer-A1 are o adenină numai în poziția 1, în timp ce 7mer-m8 are asocierea bazei numai în poziția 8. În schimb, 6mer nu are nici o adenină în poziția 1, nici asocierea bazei în poziția 8 .
în plus față de recunoașterea strictă a semințelor, este posibilă și recunoașterea moderată strictă, deoarece riscul poate tolera mici nepotriviri sau perechi de oscilații în regiunea semințelor. Stabilitatea termodinamică a unei perechi de oscilații (cum ar fi G:U) este comparabilă cu cea a unei perechi Watson–Crick .
asocierea Watson–Crick în partea 3′ a moleculei miARN este cunoscută pentru a spori eficacitatea recunoașterii site-ului în țintele miARN care au împerecherea semințelor . Numărul de nucleotide preferat de potriviri din partea 3′ diferă între site-ul care are împerechere strictă a semințelor și cel care are împerechere moderată-strictă-a semințelor . Semințele stricte necesită 3-4 meciuri în pozițiile 13-16, în timp ce semințele moderate-stricte-necesită 4-5 meciuri în pozițiile 13-19. Site-urile cu această asociere suplimentară de 3′ se numesc site-uri 3-suplimentare și 3′ compensatorii .
s-a demonstrat pe larg că marea majoritate a secvențelor de recunoaștere a țintei miARN se găsesc în 3′-UTR a genei țintă, chiar dacă riscul încărcat de miARN poate lega teoretic orice segment de ARNm. Genele țintă au, în general, 3′ UTR mai lungi, în timp ce anumite gene omniprezente, cum ar fi genele de păstrare a casei, tind să aibă 3′ UTR scurte, potențial pentru a evita să fie reglementate de miARN . Site-urile țintă nu sunt distribuite uniform cu 3′ UTR. Acestea sunt situate în apropierea ambelor capete pe 3′ UTR lung (în general, 2000 NT). Pentru 3′ UTR mai scurte, site-urile țintă tind să fie la ~15-20 nt distanță de codonul de oprire .
deși se consideră, în general, că siturile funcționale miARN sunt localizate preferențial în 3′ UTR, siturile de semințe din secvența de codificare și regiunile 5′ UTR pot promova, de asemenea, reglarea descendentă a ARNm . Baza pentru legarea preferențială a miARN în 3 ‘ UTR poate avea o serie de explicații. De exemplu, RISC poate fi necesar să concureze cu alte complexe proteice, cum ar fi ribozomii, legarea la secvența de codificare și complexele de inițiere a traducerii în 5′ UTR. Ca atare, 3’ UTR ar putea fi pur și simplu mai accesibil pentru legarea pe termen lung decât celelalte două site-uri .