rolul modificărilor proteice ale T-Bet în producția de citokine și diferențierea celulelor T Helper

rezumat

T-Bet (proteina T-box exprimată în celulele T, numită și TBX21) a fost inițial clonată ca un factor cheie de transcripție implicat în angajamentul celulelor T helper (Th) la linia Th1. T-Bet activează direct transcrierea genei IFN și îmbunătățește dezvoltarea celulelor Th1. T-Bet modulează simultan citokinele IL-2 și Th2 într-o manieră independentă IFN, rezultând o atenuare a dezvoltării celulelor Th2. Numeroase studii au demonstrat că t-bet joacă roluri multiple în multe subtipuri de celule imune, inclusiv celula B, celulele dendritice, celulele ucigașe naturale (NK), celulele T NK și celulele limfoide înnăscute. Prin urmare, t-bet este crucial pentru dezvoltarea și coordonarea răspunsurilor imune înnăscute și adaptive. Pentru a îndeplini aceste roluri multiple, T-bet suferă mai multe modificări ale proteinelor posttranslaționale, cum ar fi fosforilarea la reziduurile de tirozină, serină și treonină și ubiquitinarea la reziduurile de lizină, care afectează angajamentul descendenței în timpul diferențierii celulelor. Această revizuire prezintă o imagine de ansamblu actuală a progreselor înregistrate în înțelegerea rolurilor diferitelor tipuri de modificări ale proteinelor T-bet în reglarea producției de citokine în timpul diferențierii celulelor Th.

1. Introducere

T-Bet (proteina T-box exprimată în celulele T, numită și TBX21) a fost descrisă pentru prima dată în 2000 într-un raport care examinează efectele t-bet asupra diferențierii celulelor T helper 1 (Th1). În ultimii 15 ani, multe studii au examinat funcțiile T-bet și au relevat roluri multiple pentru această proteină în timpul diferențierii celulelor Th, cu accent pe mecanismele moleculare implicate, funcțiile noi ale acestui factor de transcripție în celulele imune înnăscute și modularea mediată de t-bet a bolilor inflamatorii . S-a clarificat faptul că T-bet joacă un rol critic în coordonarea imunității înnăscute și a imunității adaptive și că îndeplinește o funcție importantă în modularea bolilor inflamatorii cronice, inclusiv astmul și boala inflamatorie intestinală, prin controlul unei rețele de programe genetice foarte conservate . Astfel, reglarea optimă a expresiei și activității T-bet pare a fi benefică pentru prevenirea sau tratarea inflamației cronice și a bolilor autoimune.

deși s-au făcut încercări de identificare a moleculelor mici care controlează expresia și activitatea t-bet care afectează răspunsul imun mediat de celulele T, până în prezent s-au făcut puține progrese în acest sens. Având în vedere importanța T-bet în reglarea imună, elucidarea mecanismelor funcționale care stau la baza rolurilor multiple ale T-bet ar facilita dezvoltarea unor noi intervenții terapeutice pentru tratarea bolilor inflamatorii cronice și autoimune. Această revizuire rezumă stadiul actual al cunoștințelor despre mecanismele moleculare care stau la baza rolurilor multiple jucate de T-bet în dezvoltarea celulelor Th.

2. Structura t-Bet

t-bet conține un amino-terminal, un domeniu T-box și un carboxil-terminal, care prezintă omologie de 82%, 100% și, respectiv, 79% între șoareci (530 proteine reziduale de aminoacizi) și oameni (535 proteine reziduale de aminoacizi) (Figura 1). Domeniul T-box, situat între reziduurile 135 și 326 din mouse-ul t-bet, este foarte conservat în 18 membri ai familiei proteinei T-box (TBX). Caracteristicile comune împărtășite de proteinele T-box includ o capacitate de legare a ADN-ului prin domeniul T-box și activitatea de reglementare transcripțională, care joacă un rol în controlul expresiei genei de dezvoltare la toate speciile de animale.

Figura 1

structura și modificarea proteinelor T-bet. Mouse-ul și uman t-bet este 100% identic în domeniul T-box. Mai multe reziduuri de aminoacizi sunt conservate la șoareci și suferă modificări posttranslaționale, inclusiv fosforilarea la reziduurile de serină, treonină și/sau tirozină și ubiquitinarea la reziduurile de lizină.

domeniul T-box este alcătuit din aproximativ 180 de reziduuri de aminoacizi și este suficient și necesar pentru legarea la secvența ADN consensuală TCACACCT . Brachyury (T) a fost prima proteină T-box care a fost identificată și, în formă dimerică, interacționează cu canelurile majore și minore ale ADN-ului prin interacțiuni hidrofobe și contact carbonilic neobișnuit cu lanțul principal cu o guanină ca dimer . TBX1 se leagă, de asemenea, de secvența ADN ca dimer, în timp ce TBX2 pare să se lege de aceeași secvență ADN ca un monomer . Deși TBX1 și TBX2 au o identitate de 61% în domeniul T-box, structura complexului de legare ADN-T – box pare a fi diferită, din cauza omologiei scăzute dintre regiunile amino-și carboxil-terminale. Domeniul T-box din t-bet prezintă o omologie de 50% cu domeniul corespunzător din brachyury (T), TBX1 și TBX2; cu toate acestea, structura cristalină a t-bet legată de secvența ADN rămâne de caracterizat.

3. Reglarea diferențierii celulelor Th prin T-Bet

3.1. Stimularea diferențierii celulelor Th1 prin T-Bet

T-bet se leagă direct de secvența ADN consensuală din cadrul promotorului IFNG și activează transcrierea acestuia. Expresia indusă de t-bet a IFNG derivă celulele precursoare Th pentru a se diferenția în celulele efectoare Th1. În timp ce supraexprimarea exogenă a t-bet în celulele na-VIII crește preferențial dezvoltarea celulelor Th1, deficiența T-bet duce la eșecul producerii suficiente IFN-uri și, prin urmare, reduce generarea de celule Th1 . Expresia t-bet este substanțial crescută prin stimularea receptorului de celule T (TCR) și este mărită prin cotratament cu IFN-XV și IL-12. IFN-XV se leagă de receptorul său și induce activarea traductorului de semnal și activatorul transcripției (STAT) 1 și transcripția genei T-bet (TBX21). Ulterior, t-bet stimulează direct transcrierea IFNG, precum și a IL12RB2. Expresia receptorului IL-12 (IL-12R) inkts2 pe suprafața celulei îmbunătățește și mai mult producția IFN-inktsif prin IL-12 și calea de semnalizare STAT4, rezultând astfel diferențierea preferențială a celulelor Th1. Interesant este că expresia forțată T-bet poate converti, de asemenea, celulele Th2 diferențiate în celule Th1 . Prin urmare, t-bet este poziționat la punctul central al căilor de reglementare care induc IFN-inktif în celulele Th.

3.2. Atenuarea producției de IL-2 de către T-Bet

în plus față de reglarea IFN-XV, t-bet suprimă semnificativ expresia. Această citokină, un factor de creștere a celulelor T timpurii, este esențială pentru activarea, proliferarea și diferențierea celulelor Th și este produsă abundent la stimularea TCR. T-bet introdus ectopic suprimă semnificativ producția de IL-2 prin inhibarea activității factorului nuclear kB (NF-kB) p65, în condiții de diferențiere atât Th1, cât și Th2 . În timpul diferențierii celulelor Th1, transcrierea IL-2 este, de asemenea, atenuată la inducerea t-bet. Inhibarea IL-2 mediată de t-bet poate afecta expansiunea celulelor Th și poate modula în mod deosebit răspunsul imun mediat de Th1 la expunerea la un antigen patogen.

3.3. Suprimarea dezvoltării celulelor Th2 de către T-Bet

mai mult, introducerea exogenă a t-bet în celulele Th suprimă producția de citokine Th2, cum ar fi IL-4, IL-5 și IL-13, prin suprimarea GATA-legarea proteinei-3 (GATA-3). În consecință, lipsa t-bet induce dezvoltarea spontană a celulelor Th2 in vitro și in vivo . Activitatea de supresie a Th2 a t-bet a fost confirmată și în absența IFN-XV, indicând faptul că T-bet are o funcție inhibitoare discretă, independentă de stimularea IFN-XV.

3.4. Alte funcții ale T-Bet

recent, multe studii au raportat că T-bet modulează și alte linii celulare Th, inclusiv celulele Th17, Treg și foliculare TH (TFH), în coordonare cu mulți factori de transcripție, cum ar fi receptorul orfan legat de acidul retinoic-YT (RORyt), factorul de transcripție 3 legat de runt (RUNX3) și limfomul cu celule B-6 (BCL6) . Aceste constatări sugerează că t-bet este un factor de transcripție care este esențial pentru reglarea fină a dezvoltării celulelor Th.

4. Modificarea posttranslațională a t-Bet

t-Bet funcționează ca un jucător multitasking în reglarea diferențierii celulelor Th. Cu toate acestea, mecanismele moleculare care stau la baza activității stimulatoare și inhibitoare a t-bet în reglarea expresiei genei țintă rămân de clarificat. Se știe că multe proteine multitasking suferă modificări posttranslaționale ale proteinelor și determină destinele celulare prin exercitarea unei activități stimulatoare directe și inhibitoare indirecte asupra expresiei genei țintă .

4.1. Fosforilarea tirozinei a t-Bet

detectarea pe bază de anticorpi a proteinelor T-bet în western blots are ca rezultat mai multe benzi, sugerând modificarea posttranslațională a t-bet în celulele TH declanșate de TCR. Fosforilarea tirozinei proteinei T-bet are loc în primul rând în primele etape (zilele 2-3) ale dezvoltării celulelor Th, după implicarea TCR și scade ulterior. Tratarea celulelor Th cu pervanadatul inhibitor al tirozinei fosfatazei îmbunătățește fosforilarea tirozinei t-bet. T-Bet este localizat în principal în nucleu, iar tirozin kinaza nucleară IL2-inductibilă tirozin kinaza (ITK) a fost identificată ca tirozin kinaza responsabilă în amonte. Deficitul ITK previne fosforilarea tirozinei T-bet în celulele Th după stimularea cu TCR și IL-12. Cercetările mutaționale au arătat că reziduul de tirozină 525 (Y525) este locul relevant de fosforilare și că fosforilarea la acest loc joacă un rol important în interacțiunea cu GATA-3. Deși domeniul T-box în t-bet este important pentru interacțiunea ADN și proteină-proteină, fosforilarea tirozinei Y525 este o condiție prealabilă pentru suprimarea diferențierii celulelor TH2 mediate de GATA-3. Blocarea fosforilării Y525 abrogă interacțiunea și suprimarea GATA-3, ducând la afectarea suprimării Th2 .

mai mult, o altă tirozin kinază nucleară, c-Abl, induce fosforilarea T-bet la reziduurile de tirozină 219, 265 și 304 la t-bet de șoarece . O deficiență a c-ABL, precum și o mutație a t-bet la aceste reziduuri (mutanți Y219/265/304F) duce la o eșec de creștere a inducției IFN-XV și de suprimare a producției de citokine Th2, datorită pierderii fosforilării la aceste reziduuri de tirozină. Aceasta, la rândul său, duce la agravarea inflamației pulmonare alergice in vivo . Aceste constatări sugerează că fosforilarea tirozinei indusă de ITK și c-ABL a T-bet este esențială pentru modularea dezvoltării celulelor Th2 și a răspunsului imun alergic.

4.2. Fosforilarea serină a T-Bet

deși suprimarea mediată de t-bet a dezvoltării celulelor Th2 este afectată de mutația Y525 și absența c-ABL kinazei, suprimarea IL-2 este reținută cu un t-bet mutant Y525, sugerând existența unui mecanism suplimentar de reglare pentru modularea IL-2 . Interesant este că apariția mai multor benzi de proteine T-bet pe western blots ar putea fi eliminată prin adăugarea de fosfatază intestinală a vițelului, care elimină predominant fosforilarea la reziduurile de serină/treonină. Analiza spectrometrică de masă a relevat apoi Serina 508 (S508) ca un alt loc de fosforilare în T-bet. Mutația S508 elimină fosforilarea mediată de cazeină kinază – (CK -) și glicogen sintază kinază-3 (GSK-3 -) în t-bet, precum și activitatea IL–2-supresivă a proteinei. Mai mult, fosforilarea S508 este importantă pentru interacțiunea T-bet cu NF-kB p65 și pentru prevenirea legării NF-kB p65 la promotorul IL2. În conformitate cu funcția T-bet ca inhibitor NF-kB p65, celulele T-bet-null Th1 susțin activitatea NF-kB p65 în timpul diferențierii celulelor Th1 și astfel produc mai mult IL-2. Prin urmare, s-a sugerat că t-bet este un inhibitor fiziologic al IL-2 în timpul diferențierii celulelor Th1, prin suprimarea dependentă de fosforilare S508 A NF-kB p65.

4.3. Treonina fosforilarea T-Bet

foarte recent, treonina 302 (T302) a fost caracterizată ca un nou situs de fosforilare în T-bet , deși rămâne neclar ce kinază și fosfatază afectează fosforilarea acestui reziduu. Cu toate acestea, restaurarea celulelor T-bet-null TH cu un T302-mutant t-bet a stimulat producția IFN-XV la fel de mult ca și t-bet de tip sălbatic; cu toate acestea, mutantul nu a reușit să suprime IL-2 și alte citokine Th2. Analiza ulterioară a demonstrat că fosforilarea T302 este necesară pentru interacțiunea T-bet cu factorul nuclear al celulelor T activate (NFAT) și pentru reglarea în jos a citokinelor IL-2 și Th2 mediate de NFAT, cum ar fi IL-4, IL-5 și IL-13. NFAT nu este crucial pentru inducerea producției IFN-XV, iar T302-mutant t-bet este capabil să se lege de promotorul IFNG; astfel, producția IFN-XV a fost comparabilă între t-bet de tip sălbatic și mutant. Cu alte cuvinte, mutația T302 a abrogat supresia mediată de t-bet a producției de citokine IL-2 și Th2, dar nu a afectat activitatea de legare a ADN-ului și IFN-uri-stimulatoare a T-bet.

într-adevăr, T302 este localizat în caseta T de legare a ADN-ului, la fel ca și Y304 . Domeniul T-box este format din mai multe repetări de catene și helice de la XV și este implicat atât în dimerizare, cât și în legarea ADN-ului . Muller și Herrmann au prezis că helicele AH3 și aH4 din brachyury (T) sunt importante pentru interacțiunea directă a acestei proteine cu canelurile minore și majore ale ADN-ului . Cu toate acestea, T302 nu poate fi asociat direct cu canelurile ADN, indiferent de starea sa de fosforilare. Ar fi interesant de știut care kinază și fosfatază din amonte reglează fosforilarea T302 și dacă fosforilarea T302 afectează alte modificări ale proteinelor T-bet.

4.4. Ubiquitinarea lizinei 313 în t-Bet

expresia t-bet este esențială pentru reglarea transcripțională a IFNG și pentru dezvoltarea celulelor Th1, dar mijloacele de reglare a t-bet la nivelul proteinei nu sunt încă identificate. Jang și colab. au raportat recent că t-bet suferă degradarea proteazomală mediată de ubiquitinare în etapele ulterioare ale diferențierii celulelor Th1 . Din cele 16 reziduuri de lizină prezente în proteina t-bet de șoarece, 11 sunt localizate predominant în domeniul T-box, iar restul de 5 sunt situate la capătul carboxil (reziduuri de la 326 la 530), în timp ce nu sunt prezente reziduuri de lizină în amino-terminal (reziduuri de la 1 la 134). Interesant este că reziduurile de lizină din domeniul T-box sunt preferențial ubiquitinate la supraexprimarea ubiquitinei. Analiza ulterioară a identificat că mutația lizinei 313 (K313) scade degradarea t-bet mediată de ubiquitinare și îmbunătățește nivelul de Expresie al t-bet în nucleu și citoplasmă. În ciuda nivelurilor crescute ale mutantului K313, această mutație a abrogat complet funcțiile T-bet care implică legarea ADN-ului, activarea transcripțională a IFNG și suprimarea producției de citokine IL-2 și Th2. Structura cristalină a elicelor de tip X-X ale domeniului T-box legat de ADN sugerează cu tărie că gruparea amino a K313 este asociată cu fosfatul unei baze ADN prin interacțiunea hidrogen-legătură. În plus, mutația K313 duce, de asemenea, la eșecul suprimării producției de citokine IL-2 și Th2; cu toate acestea, interacțiunea și suprimarea GATA-3 și NF-kB p65 nu sunt modificate de mutația K313. Interesant este că interacțiunea NFAT este abolită în k313-mutant t-bet, care este, de asemenea, puternic asociată cu absența fosforilării la T302. Nu este clar încă dacă și cum k313 reglează fosforilarea T302 și invers.

5. T-Bet în bolile inflamatorii și autoimune

de când Mosmann și colab. descoperite Th1 și Th2 subseturi care produc citokine semnate, IFN-XV, și IL-4, IL-5 și IL-13, respectiv, și care modulează răspunsurile imune inflamatorii și alergice , studii suplimentare au identificat subseturi noi de celule Th, cum ar fi celulele Th17, TFH și treg . Studii ample au caracterizat, de asemenea, căile de semnalizare a citokinelor și factorii de transcripție implicați în reglarea răspunsurilor imune la agenții patogeni . Important, t-bet joacă un rol fundamental în controlul diferențierii mai multor subseturi de celule Th și în modularea bolilor inflamatorii și autoimune .

T-Bet funcționează, de asemenea, ca un regulator antiastmatic. O deficiență a t-bet duce spontan la dezvoltarea simptomelor astmatice, care se caracterizează prin infiltrarea eozinofilă crescută în căile respiratorii, hiperplazia celulelor calciforme secretoare de mucus și remodelarea cronică a căilor respiratorii cu acumulare de colagen și miofibroblaste proliferative; aceste caracteristici sunt adesea observate și la pacienții astmatici . Restaurarea expresiei T-bet schimbă echilibrul imun la un răspuns Th1 și previne și atenuează inflamația pulmonară patologică in vivo .

mai mult, T-bet este protejat împotriva infecțiilor patogene intracelulare. Abrogarea producției induse de t-bet IFN-XV a avut ca rezultat o susceptibilitate mai mare la agenții patogeni intracelulari in vivo, inclusiv Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major și Salmonella typhimurium, subliniind importanța producției IFN-XV de către celulele Th1 care exprimă t-bet în apărarea împotriva infecțiilor bacteriene. Cu toate acestea, șoarecii cu deficit de t-bet sunt rezistenți la infecția cu Listeria monocytogenes, deoarece producția INF-centi de către celulele ucigașe naturale este atât necesară, cât și suficientă pentru apărarea gazdei împotriva L. monocytogenes .

Mai Mult, T-bet poate agrava dezvoltarea bolilor inflamatorii și autoimune, inclusiv boala inflamatorie intestinală, encefalomielita autoimună experimentală, artrita inflamatorie și diabetul de tip I, deoarece aceste boli inflamatorii sunt atenuate în absența T-bet . Aceste descoperiri sugerează că reglarea fină a răspunsului imun prin modularea expresiei T-bet ar putea avea efecte benefice pentru pacienții cu astm cronic, boli inflamatorii intestinale, artrită, scleroză multiplă și diabet.

6. Concluzii și perspective

T-bet este un factor de transcripție care conține domeniul T-box, care este de obicei implicat în reglarea dezvoltării, dar exercită mai multe funcții în diferențierea celulelor Th; activarea transcripțională a celulelor Th1 care exprimă IFN-XV, suprimarea indirectă a dezvoltării celulelor Th2, Th17 și Treg și modularea fină a producției IL-2 în celulele Th1. Acest multitasking nu este surprinzător, deoarece t-bet suferă mai multe modificări posttranslaționale. Fosforilarea la Y525 joacă un rol în suprimarea GATA-3 în timpul reglării Th2, fosforilarea la S508 provoacă suprimarea NF-kB p65 în contextul reglării IL-2 în celulele Th1, fosforilarea la T302 joacă un rol în reglarea fină a producției IL-2 și ubiquitinarea la K313 joacă un rol în controlul stabilității proteinei T-bet. Astfel, modificarea posttranslațională a T-bet facilitează diversitatea sa funcțională și complexitatea modulării expresiei citokinelor (Figura 2). Nu se știe dacă diferitele modificări posttranslaționale apar secvențial sau simultan, dacă un tip de modificare a proteinelor afectează alte modificări sau dacă modificările modificării posttranslaționale a t-bet sunt legate de dezvoltarea bolilor inflamatorii infecțioase și cronice. Identificarea ulterioară a noilor modificări ale proteinelor legate de funcțiile T-bet ar oferi informații valoroase despre dezvoltarea unor intervenții terapeutice puternice pentru controlul bolilor inflamatorii cronice și autoimune.

Figura 2

mai multe funcții T-bet joacă un rol în diferențierea celulelor Th. Inducerea expresiei T-bet prin activarea STAT1 și STAT4 stimulează direct transcrierea genelor care conțin elemente de legare a cutiei T, cum ar fi IFNG, IL12RB2 și CXCR3, sporind astfel dezvoltarea celulelor Th1. T-Bet suferă fosforilarea serinei la S508 și apoi reglează producția de IL-2 în celulele Th1 prin recrutarea NF-kB p65 de la promotorul IL2. Nivelurile de proteine ale T-bet în celulele Th1 pot fi controlate de calea de degradare proteazomală mediată de ubiquitină. Mai mult, proteina T-bet suferă modificări posttranslaționale suplimentare, de exemplu, fosforilarea la T302 și Y525, ceea ce facilitează suprimarea producției de citokine Th2 care este indusă prin activarea NFAT și GATA-3.

Lista abrevierilor

conflictul de interese

nu a fost dezvăluit niciun potențial conflict de interese.

recunoaștere

această lucrare a fost susținută de programul de cercetare la mijlocul carierei prin Grant NRF (2013r1a2a2a01068302).