ELISA-analysen ger tre olika typer av datautgång:
kvantitativ
ELISA-data kan tolkas i jämförelse med en standardkurva (en seriell utspädning av ett känt, renat antigen) för att exakt beräkna koncentrationerna av antigen i olika prover (Figur 6).
kvalitativ
ELISAs kan också användas för att uppnå ett ja eller nej-svar som indikerar om ett visst antigen är närvarande i ett prov, jämfört med en blank brunn som innehåller inget antigen eller ett orelaterat kontrollantigen.
semikvantitativ
ELISAs kan användas för att jämföra de relativa nivåerna av antigen i analysprover, eftersom signalintensiteten varierar direkt med antigenkoncentrationen.
standardkurva
ELISA-data ritas vanligtvis med optisk densitet jämfört med logkoncentration för att producera en sigmoidkurva som visas i Figur 6. Kända koncentrationer av antigen används för att producera en standardkurva och sedan används dessa data för att mäta koncentrationen av okända prover jämfört med den linjära delen av standardkurvan. Detta kan göras direkt på grafen eller med kurvan montering programvara som vanligtvis finns på ELISA platta läsare.
Fig. 6. En typisk ELISA standardkurva.
Kalibreringskurvmodeller
om ett kvantitativt resultat behövs, är det enklaste sättet att gå vidare att genomsnitt tre exemplar av standardavläsningarna och dra av avläsningen av det tomma kontrollprovet. Därefter plottar du standardkurvan, hittar linjen med bästa passform eller åtminstone ritar en punkt till punktkurva så att koncentrationen av proverna kan bestämmas. Eventuella utspädningar måste justeras för i detta skede. Detta är i allmänhet den praktiska utsträckning som manuell beräkning kan tas.
en variation är att plotta data med hjälp av semi-log, log / log, log / logit och dess derivat – 4 eller 5 parameter logistiska modeller. Att använda mjukvarubaserade / automatiserade lösningar gör det möjligt att överväga mer sofistikerade grafmetoder. Att använda linjär regression i ett mjukvarupaket lägger till flera fler kontrollmöjligheter; det är möjligt att kontrollera R2-värdet för att bestämma övergripande godhet av passform. För den del av kurvan där förhållandet mellan koncentration och avläsning har ett linjärt förhållande representerar R2-värden >0,99 en mycket bra passform. Noggrannheten kan sedan förbättras ytterligare genom att använda ytterligare standardkoncentrationer i det intervallet.
en aspekt av det linjära diagrammet är att det komprimerar datapunkterna på de lägre koncentrationerna av standardkurvan, vilket gör det till det mest exakta intervallet (område som sannolikt uppnår det önskade R2-värdet). För att motverka denna komprimering kan ett halvloggdiagram användas; här plottas loggen för koncentrationsvärdet (på x-axeln) mot avläsningen (på y-axeln). Denna metod ger en S-formad datakurva som distribuerar mer av datapunkterna till det mer användarvänliga sigmoidmönstret.
loggen / loggen (log of concentration against log of readout) plottyp lyckas linjärisera mer av datakurvan. Det låga till medelstora standardkoncentrationsområdet är i allmänhet linjärt i denna modell, endast den högre änden av intervallet tenderar att luta av. Loggen / logit och dess derivat, 4-eller 5-parameterns logistiska modeller, är mer sofistikerade och kräver mer komplexa beräkningar och uppskattningar av max -, min -, EC50-och lutningsvärden. 5-parametermodellen kräver dessutom asymmetrivärdet.
även om dessa kalibreringskurvmodeller kan ge förbättrad prestanda, skulle en bra utgångspunkt vara att använda log-log-plottet med en kontroll av återhämtningsprocenten (analytåterställning från spikade prover). Alternativt är åtminstone’ back-fitting ’standardkurvavläsningsvärdena ofta’ en tillräckligt bra’ – metod. Det enklaste sättet att kontrollera är att beräkna kalibreringsstandarderna och kontrollera att de faller inom 20% av det nominella avläsningsvärdet. En varning är att inte förlita sig på ’bra’ R2-värden och hitta den kalibreringskurvmodellen som ger de bästa återställningsvärdena för standarderna.
ELISA-känslighet
ELISAs är en av de mest känsliga immunanalyserna som finns tillgängliga. Det typiska detekteringsområdet för en ELISA är 0,1 till 1 fmol eller 0,01 ng till 0,1 ng, med känslighet beroende på de speciella egenskaperna hos antikropp-antigeninteraktionen. Dessutom kan vissa substrat, såsom de som ger förbättrad kemiluminescerande eller fluorescerande signal, användas för att förbättra resultaten.
som tidigare nämnts kommer indirekt detektering att ge högre signalnivåer och bör därför vara känsligare. Det kan emellertid också orsaka högre bakgrundssignal och därmed minska nätspecifika signalnivåer.