kristallstrukturen hos ett tetrahydrofolatbundet dihydrofolatreduktas avslöjar ursprunget för långsam produktfrisättning

isolering genom kristallisering av det endogena (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolatbundet E. coli DHFR-komplex

strukturen hos det endogena edhfr:FH4 binärt komplex bestämdes genom molekylär ersättning med användning av edhfr:folat:NADP+ stängt Ternärt komplex (PDB ID: 7dfr)50. Såsom visas i Fig. 2, bekräftar den klara elektrontätheten den co-renade endogena liganden som FH4 baserat på den tetraedriska geometrin hos sp3 C6 överensstämmer med en 6s stereoisomer. Detta står i kontrast till trigonal plan geometri av sp2 C6 i ett FH2 binärt komplex erhållet från liknande kristalliseringsbetingelser.

jämförelse av ligandstrukturerna i eDHFR:FH4 (grön, toppfigur) och eDHFR: FH2 (orange, bottenfigur) komplex. De fo-Fc utelämna elektrondensitetskartor konturerade runt liganderna visas på 3.0-nivå i den. Vyerna till höger roteras 90 msk moturs om den vertikala axeln från de perspektiv som visas till vänster. FH4 och FH2 visas som pinnar. C6-kolatomen är färgad i magenta, och dess olika hybridiseringstillstånd i FH4 och FH2 indikeras av magenta pekande pilar. Alla andra atomer är färgade enligt följande: syre i rött, kväve i blått, kol i grönt och orange för FH4 respektive FH2. Endast icke-väteatomer visas för enkel visning

i ett försök att förstå varför vi får FH4-komplexet, medan andra har misslyckats, identifierade vi att ursprunget för de två olika ligandkomplexen (FH4 vs. FH2) är tidpunkten för kristallskörd och därmed kristalltillväxtens varaktighet. En tidskursstudie som visas i Fig. 3 som följer förändringarna av elektrondensiteter hos den bundna liganden vid olika dagar av kristalltillväxt avslöjade att FH4 till FH2-sönderfallet (reflekterat i SP3 till sp2-övergången vid C6-position) inträffade ungefär 2-3 dagar efter kristallisering upprättad.

Stereovyer av tidskursen för Fo-Fc utelämnar förändringar i elektrondensitetskartan som motsvarar omvandlingen av FH4 till FH2. De fo-Fc utelämna elektrondensitetskartor konturerade runt liganderna visas på 3.0-nivå i den. EDHFR:FH4 binära komplexa kristaller odlades i mörkret vid rumstemperatur. Vid varje tidpunkt skördades en enda kristall från en oberoende kristalldroppe genom blixtfrysning för röntgendiffraktion. Ligandstrukturerna för FH4 och FH2 av fullständigt raffinerade binära komplexa strukturer vid 2 respektive 14 dagar visas i varje figur som referenser för att jämföra med förändringen av elektrondensiteter. Utelämningskartorna för kristallerna skördade vid 3 och 6 dagar genererades efter initial strukturell förfining utan att införa ligander eller lösningsmedel. Superposition av proteinstrukturerna utfördes med användning av PyMOL69

Detta är första gången vi vet att ett autentiskt FH4-bundet DHFR-komplex med en domän har isolerats. Vi har validerat protokollet för att reproducera kristalliseringen av eDHFR: FH4-komplexet och bekräftat tidsförloppet för FH4 till FH2-sönderfall med minst två oberoende replikat vid varje tidpunkt för kristallskörd (kompletterande Fig. 1). De mellanliggande elektrondensiteterna längs tiden för ligandens sönderfall visar tydligt SP3 till sp2-övergången vid C6-positionen och samtidig rotation av bensoylringen hos den bundna liganden (Fig. 3). Detta kan likna övergångstillståndet ligand konformation i framåt katalytisk riktning. Det observerade FH4 till FH2-förfallet under kristalltillväxt återspeglar sannolikt inte omvänd katalys av DHFR som involverar omvandlingen av FH4 till FH2. Det induceras förmodligen inte av ljus, med tanke på att kristallisationsdropparna inkuberades vid rumstemperatur i mörkret under kristalltillväxt, och tidsförloppet för FH4 till FH2-sönderfall är i storleksordningen dagar. Vi har också testat samkristallisering med reduktionsmedlen ditiotreitol(DTT) eller Tris (2-karboxietyl)fosfin (TCEP) vid 2-3 mM koncentration samt införande av DTT eller TCEP i upp till 20 min kristallblötning före skörd vid 2 dagar, 3 dagar, 14 dagar upp till 7,5 månader. Återigen påverkade dessa procedurer inte reproducerbarheten av ligandelektrondensitetsförändringar kvalitativt längs sönderfallstiden för eDHFR: FH4-komplexet i den kristallina formen som identifierades i denna studie (kompletterande Fig. 1). Således är det troligt att det nuvarande kristalliseringsprotokollet företrädesvis kristalliserar det endogena FH4-komplexet som renas i eDHFR-proteinproverna och dess sönderfall i kristallen är irreversibelt under de förhållanden vi testade, troligen på grund av oxidation vid en ändlig nivå av syre. Även om den snabba framåt katalytiska reaktionen att producera FH4 från FH2 är termodynamiskt gynnad i närvaro av överskott av NADPH som in vivo, kan det långsamma förfallet av FH4-komplexet tillbaka till ett FH2-komplex ske utan fortsatt tillförsel av NADPH som vi observerade här under in vitro-kristalliseringstillståndet. Således visade sig mysteriet om varför det långvariga FH4-komplexet var svårt att erhålla vara dess inneboende instabilitet. Det är mycket troligt att nyckeln till vår framgång för att erhålla den kemiskt labila FH4-komplexa strukturen är den aktuella skörden av väldiffraktionskristaller inom 2 dagars tillväxt under kristallisationsförhållandet som identifieras här. Dessutom indikerar en undersökning av DHFR-fältet att många kristallografiska19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 och NMR12,13,15,17,19,25,26 studier av DHFR tillämpade dialys för att avlägsna endogena ligander innan de exogena liganderna av intresse infördes. Vi identifierade ett kristalliseringstillstånd som isolerar det endogena FH4-bundna DHFR-komplexet utan dialys av proteinprovet eller införande av ytterligare substrat eller produkter. Vi postulerar att det nuvarande kristallisationsförhållandet för eDHFR: FH4-komplexet gynnar den FH4-bundna formen över andra former såsom eDHFR:FH2:NADP(H) ternära komplexet.

strukturell karakterisering av eDHFR:FH4-komplexet

FH4-komplexet antar en ockluderad konformation i eDHFR (se fig. 4 och 5). Detta överensstämmer med de tidigare resultaten som tyder på att alla grundtillstånd FH4 binära och ternära komplex av den katalytiska cykeln (posthydridöverföring och sp2 till sp3-omvandling vid C6) förekommer i ockluderade konformationer. Detta beror på den steriska kollisionen av den lutade pterin-ringen av FH4 med nikotinamidringen av NADP (H), vilket skulle inträffa i den slutna konformationen av Met20-slingan (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Såsom anges i Fig. 4, FH4 har van der Waals-kontakter och gynnsamma polära interaktioner med aktiva platsrester och vatten. I synnerhet förankrar två bidentatsaltbryggor med Asp27 och Arg57 de två ändarna av FH4, aminopyrimidin (N3 och exocyklisk-NH2) respektive sackariokarboxylat i nästan identiska positioner som i substrat/analoga komplex12, 20, 24, 45.

den aktiva webbplatsstrukturen för eDHFR: FH4-komplexet visas i stereovyer. en sidokedja (cyan) inom 4 kg FH4 (grön) och Met20-slingan (gul) visas som pinnar. Sekundära strukturer visas som karikatyrerna i grått, och vatten inom 3,5 kcal av FH4 som sfärer. Polära interaktioner med FH4 indikeras med streckade linjer. Fo-Fc-elektrondensitetskartan som utelämnar FH4 visas på en 3.5-nivå i rött och 2FO-Fc-utelämningskartan på en 1.0-nivå visas i blått för rester och vatten. De tre konformerna av Ile14-Gly15 amidbindningar indikeras med en streckad cirkel och röda pilar. B en utökad vy av Ile14-Gly15-kopplingen

Superposition av FH4-komplexet med FH2-och FH4-analoga komplex. De nuvarande FH4 -, FH2-och rapporterade eDHFR-komplexen och det rapporterade 5-formyl-FH4-komplexet tillsammans med deras ockluderade Met20-slingkonformationer, Phe31-rester och motsvarande ligander är färgade i grönt, magenta respektive gult. Alla andra strukturer från PDB-ID: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1rf7 (FH2)24, 4pdj (FH2:NADPH)20 och 4PSY (folat:NADP+)20 är färgade grå. Den röda streckade cirkeln indikerar föreslagna växelverkan mellan mellan phe31 och ligandbensoylgrupperna som antar två distinkta orienteringar beroende på de bundna liganderna. FH4 och 5-formyl-FH4 tillhör ett kluster i motsats till ddFH4, FH2 och folat, medan phe31-sidokedjorna stannar i nästan samma position i alla inriktade strukturer. Met20-slingorna kategoriseras i tre allmänna konformationstillstånd, stängda, delvis stängda och ockluderade. Endast de slutna konformationerna kan strukturellt rymma nikotinamidgruppen i NADP (H) – kofaktorn som kommer in i det aktiva stället

det finns två vattenmolekyler som överbryggar Met20-slingan och FH4 via ett vätebindningsnätverk som involverar Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) och Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Dessa interaktioner är frånvarande i de tidigare rapporterade (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolat (ddFH4) komplex12,45 på grund av n till C-ersättningen vid 5 och 10-positionerna i analogen. Detta kan orsaka den observerade skillnaden i Met20-konformationen i analogen jämfört med FH4-komplexet (Fig. 5). De enda tillgängliga strukturerna i PDB som liknar Met20-slingkonformationen i FH4-komplexet är ett 5-formyl-FH4-komplex (Fig. 5, PDB ID: 1JOM) 51 och två eDHFR-nanobody allosteriska hämmande komplex som riktar sig mot olika DHFR-epitoper med nanomolär affinitet (kompletterande Fig. 2, PDB-ID: 3K74 och 4EIG) 28,29. 5-formyl-FH4-komplexet bevarar överbryggningsvattnet mellan Glu17(NH) och FH4 (N10) som i FH4-komplexet, trots deras olika rymdgrupper P61 respektive P212121. 5-Formyl-FH4, även känd som folinsyra eller leucovorin, är ett FDA-godkänt ”rescue” – läkemedel för att förhindra skadliga effekter av metotrexat under kemoterapi53. Den FH4-karboxylgruppen visar liten elektrontäthet (Fig. 4), vilket tyder på störning eller mer frihet för bindningsrotation runt C-cy eller Cy-C-C-C-axeln än i andra delar av liganderna.

förutom vattennätet fann vi det strukturella ursprunget för de stabiliserande interaktionerna i FH4-komplexet och långsam produktfrisättning baserat på strukturell jämförelse av nuvarande FH4-och FH2-binära komplex och tidigare rapporterade eDHFR-strukturer. För det första resulterar van der Waals-kontakten med Glu17-sidokedjan i ytterligare avskärmning av FH4 från lösningsmedel (Fig. 4) som är frånvarande i substrat eller produkt analog (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolat komplex12,20,24,45. För det andra föreslår den klara elektrontätheten av tre alternativa ryggradskonformationer av den konserverade Ile14-Gly15-amidlänken ett entropiskt bidrag till stabiliteten hos FH4-komplexet från den lokala Flexibiliteten vid Met20-slingankaren (Fig. 4). I synnerhet visade tidigare mutagenesstudier att Ile14 är avgörande för att kontrollera flexibiliteten hos Met20-slingan, medan i14v -, I14a-och i14g-varianter alla visade en långsammare hydridöverföringshastighet, högre flexibilitet hos Met20-slingan som observerats i en öppen konformation i kristallstrukturer, ökat temperaturberoende av primär kinetisk isotopeffekt och en högre övergångstillståndsaktiveringsenergi beräknad från hybrid QM/MM-simuleringar23, 40. För det tredje, rotation av bensoylringen leder till elektrostatiskt gynnsamma kant-till-ansikte–interaktioner med den konserverade phe31 i FH4-komplexet i motsats till proton-nära-proton (kant-till-kant) repulsiva interaktioner i FH2 -, folat-och ddFH4-komplex oavsett NADP(H) – Bindning (Fig. 5, utökad vy, Fig. 6)54,55. Den funktionella implikationen av denna strukturella förändring stöds också av observationen av den samtidiga rotationen av bensoylringen och sp3 till sp2-övergången vid C6-positionen för den bundna liganden under tidsförloppet för FH4 till FH2-sönderfall i komplexet (Fig. 3). Phe31: s roll vid kontroll av produktfrisättning bekräftas ytterligare av tidigare mutagenesstudier56, som visade att f31v-och F31Y-varianter av eDHFR visade en tvåfaldig ökning av steady – state-hastighetskonstanten kcat och en uppskattad 20-till 50-faldig ökning av produktfrisättningshastigheten utöver mutationens effekt på att sakta ner hydridöverföring.

elektrostatiska interaktioner mellan system för utveckling av systemet. Se refs 54,55 för mer information

med tanke på de dynamiska egenskaperna hos det specifika E. coli DHFR-systemet kan det stabila ockluderade eDHFR:FH4-komplexet (en lågfri energi mellanprodukt på dess dynamiska landskap) som observeras här rimligen ligga till grund för den långsamma produktfrisättningskinetiken (koff-hastigheten för FH4-dissociation, det hastighetsbegränsande steget i eDHFR-katalytisk cykel). Enligt tidigare NMR-avslappningsdispersionsstudier följer varje steg i den katalytiska cykeln av E. coli DHFR ett ”konformationsval” snarare än ”inducerad passform” – mekanism15. Följaktligen beror den mikroskopiska hastigheten för varje steg längs reaktionskoordinaten på enzymets konformationella samplingsfrekvens 15 (t.ex. övergångstillståndet som är kompetent för snabb hydridöverföring eller hastighetsbegränsande produktfrisättning). Detta innebär att ju stabilare marktillståndet, och ju mer annorlunda det är från det upphetsade substatet, desto större är den fria energikostnaden som krävs för att prova sådana konformationer. För eDHFR kommer detta nödvändigtvis att innebära omorganisation av den aktiva platsen och den flexibla Met20-slingan. Det föreslogs i NMR-avslappningsdispersionsstudier av eDHFR15 att det subpopulerade upphetsade tillståndet för hydridöverföringskemiska steget antar en ockluderad konformation (vars marktillstånd Michaelis-komplex är i en sluten konformation). Emellertid antar det subpopulerade upphetsade tillståndet för produktfrisättningssteget en sluten konformation (vars grundtillstånd FH4-komplex är i en ockluderad konformation). Längs reaktionskoordinaten ligger det för närvarande observerade eDHFR:FH4 binärt komplex mellan eDHFR:FH4:NADP+ och eDHFR:FH4:NADPH mellanliggande komplex (Fig. 1). Båda antar ockluderade konformationer, där kofaktorns nikotinamiddel pekar bort från den aktiva platsen15. För att prova det ”stängda upphetsade underlaget” under det hastighetsbegränsande produktfrisättningssteget 15 måste aktiv omorganisation av platsen från det ockluderade marktillståndet ske. Detta representeras av den stabila katalytiska mellanliggande eDHFR:FH4 fångad i denna studie. Produktdissociationshastigheten koff för FH4 ökades vid kofaktorbindning med en tvåfaldig ökning för eDHFR:FH4:NADP+ jämfört med eDHFR:FH4 och en åtta-faldig ökning för eDHFR: FH4: NADPH jämfört med eDHFR:FH4 mätt vid både pH 6 och pH 9 genom tävlingsexperiment35. Detta indikerar accelererad produktfrisättning och ökade konformationsprovtagningshastigheter när en kofaktor är bunden. Även om en autentisk eDHFR: FH4:NADPH ternary complex marktillståndsstruktur aldrig rapporterades tidigare, antar vi att det kan finnas märkbar likhet med edhfr: FH4 binärt komplex, eftersom alla FH4-bundna Mark mellanliggande tillstånd antar en ockluderad konformation15. Vi förväntar oss dock att kofaktorbindning kommer att öka befolkningen i de upphetsade substaten, som tidigare föreslagits baserat på NMR-avslappningsdispersionsstudier för att vara i en sluten konformation15. I överensstämmelse med detta observerade vi att i ett ternärt komplex av eDHFR:FH2:NADP(H) – strukturen (även bestämd i vår studie under separata kristalliseringsförhållanden) blev Met20-slingan störd. Detta antyder en allmän mekanism för kofaktor underlättat ligandutbyte genom att förbättra konformationsprovtagningsfrekvensen när kofaktorn är bunden med sin nikotinamiddel som pekar bort från det aktiva stället.

i FH4-komplexet är avståndet mellan FH4–bensoylringen (C1 kg) och Phe31 (Cz) 4,93 kg, vilket är betydligt kortare med (~0,3-0,6 kg) än motsvarande avstånd i nuvarande FH2 och tidigare rapporterade FH2-komplex (PDB ID: 1rf7, 4PDJ)20,24, som är 5,22, 5,55 respektive 5,32 kg. En liknande trend av avståndsförkortning längs reaktionskoordinaten för eDHFR betonades i två oberoende beräkningsstudier. En QM / MM-studie beräknade att motsvarande avstånd förkortas med ~0,3 kg från Michaelis-komplexet till övergångstillståndet när hydridöverföringsreaktionen inträffar och att det är liten skillnad i detta avstånd (~0,01 kg) mellan övergångstillståndet och reaktionsprodukten27. En annan studie med blandad kvant – / klassisk molekyldynamik föreslog en mer dramatisk förkortning av motsvarande avstånd med ~1 msk när reaktionen utvecklas från reaktanten till övergångsstaten18. Därför är våra kristallografiska observationer i allmänhet överens med tidigare beräkningsmodellering vilket tyder på att FH4-komplexet i viss utsträckning bevarar övergångsstatens fysiska natur. Detta överensstämmer också med tidigare observationer om edhfr: s dynamiska energilandskap kartlagt av NMR-avslappningsdispersion att varje mellanprodukt i den katalytiska cykeln tar prov låglänta upphetsade tillstånd vars konformationer liknar marktillståndsstrukturer av föregående eller följande mellanprodukter 15. Eftersom enzymer stabiliserar övergångstillståndet kan långsam produktfrisättning av DHFR-familjen bero på överföringen av övergångstillståndets fysiska natur till reaktionsproduktkomplexet. Detta föreslås från det långvariga FH4-komplexet som bestäms här, förutom artspecifika konformationsförändringar som krävs under den katalytiska cyklen32.

karakterisering av ett ockluderat komplex av eDHFR med en nanomolär bindningsaffinitet långsam inhibitor

röntgenkristallografi visar att komplexet av eDHFR med en långsam start tight inhibitor AMPQD46 visar också den ockluderade konformationen. Met20-slingan antog en konformation i AMPQD-komplexet som liknar det för det ternära komplexet med en anti-diabetisk biguanidfenformin och NADP +(PDB ID: 5UIH) 52. Å andra sidan demonstrerades det FDA-godkända kemoterapeutiska medlet metotrexat tidigare med Röntgenkristallografi24, 47,NMR48 och kinetik med en molekyl 49 för att binda i den slutna DHFR-konformationen (Fig. 7). Denna skillnad i proteinkonformationer var oväntad eftersom alla tre hämmare delar en gemensam strukturell egenskap: biguanidgruppen av fenformin, diaminopyrimidingruppen av AMPQD och diaminopteringruppen av metotrexat, var och en ansluten till en fenylgrupp med en flexibel länkare. En noggrann undersökning från den strukturella överlagringen av motsvarande eDHFR-inhibitorkomplex (Fig. 7) visade att metylaminobindningsgruppen i metotrexat (frånvarande i fenformin och AMPQD) ockuperade en position som skulle resultera i en potentiell sterisk kollision med Met20-slingan om den antog en ockluderad konformation som i fenformin-och AMPQD-komplexen. Vi visade tidigare att AMPQD visade en relativt högre preferens (en trefaldig minskning av IC-50 och Ki) för att hämma eDHFR över human DHFR46. En ännu högre artspecificitet för E. coli över human DHFR (~30-faldig) observeras för moderföreningen av AMPQD, som saknar aminofenylsvansgruppen och metylenlänkaren46. Den nuvarande kristallstrukturen hos det ockluderade komplexet av eDHFR med AMPQD ger en trolig mekanistisk förklaring till dess artspecificitet, hänförlig till skillnader i konformationsjämvikt av human DHFR vs. eDHFR. Den förstnämnda observeras uteslutande i slutna konformationer, medan den senare visar högre konformationell flexibilitet provtagning i både slutna och ockluderade konformationer, som diskuteras nästa.

struktur av eDHFR: AMPQD hämmande komplex. en Stereovy av de aktiva platsinteraktionerna med AMPQD med Fo-Fc utelämna kartan på en 3,5 hektar nivå. Protein sidokedjor (cyan) inom 4 kg AMPQD (grön) visas som pinnar, inklusive två rester från Met20-slingan (gul). Polära interaktioner indikeras med streckade linjer. B Superposition av AMPQD (grön), fenformin (gul, PDB: 5UIH)52 och metotrexatkomplex (grå visas som tunna pinnar från PDB: 1ra3, 1DD) 20,47. Met20-slingor visas som teckningar och ligander som pinnar. Ligandernas kemiska strukturer ritas ovanpå. NADP (H) visas inte i någon av strukturerna för enkel visning

jämförelse av DHFR-konformationer baserade på kluster

en kluster av DHFR PDB-strukturer med användning av Rmsd för Met20-loop-ryggraden Ca-atomer som avståndsmätvärde (Fig. 8 och kompletterande Fig. 3) indikerar att mänsklig DHFR uteslutande antar en sluten konformation (katalytiskt Kompetent för NADPH-bindning), medan eDHFR är mycket mer flexibel med både stängda och ockluderade konformationer. De ockluderade konformationerna ses mindre ofta (17%) i eDHFR-strukturer. Både det hastighetsbegränsande produktfrisättningskomplexet med FH4 och det långsamma hämmande komplexet med AMPQD antar en ockluderad konformation av eDHFR (Fig. 9) som sällan representeras i det preliminära budgetförslaget (kompletterande Fig. 3). Intressant nog delar både FH4 och AMPQD egenskaperna hos nanomolär affinitet och långsam frisättning från eDHFR35,36,46 Med positionen för de viktigaste kväveatomerna på heterocyklerna starkt bevarade och skillnader uppenbara i svansarna. Detta föreslår en ny strategi för att utveckla DHFR-hämmare genom att rikta ockluderade eDHFR-konformationer. Vi föreslår också en strategi för att bekämpa narkotikaresistens. Såsom visas i kompletterande Fig. 4, vid jämförelse av konformationen av AMPQD till FH4 och trimetoprim till FH4, finns det subtila skillnader i van der Waals-kuverten. Trimetoprim eDHFR-flyktvarianterna av E. coli DHFR har mutationer som också blockerar den hämmande funktionen hos AMPQD57. Genom att studera skillnaderna i interaktioner kan man söka efter andra ligander som minimerar dessa interaktionsskillnader med FH2 och FH4. Detta kan säkerställa att mutationer, som minskar inhibitorbindningen, också minskar bindningsaffiniteten hos FH2 och FH4.

kluster av 162 DHFR-strukturer baserat på deras parvisa Ca RMSD av Met20-slingorna. DHFR-strukturer representeras av cirklar fyllda i blått (människor), grönt (eDHFR) och rött (i denna studie). Kantlängden (färgad i lila för det ockluderade respektive guldet för de slutna konformationerna) är proportionell mot den maximala RMSD för Met20-slingkonformatorerna. Se ett mer detaljerat klusterdiagram i tilläggsinformationen

Superposition av AMPQD (grön) och FH4-komplex (gul). Met20-slingorna visas som teckningar och ligander som pinnar. Vyn till höger roteras 90 msk medurs om den vertikala axeln ur perspektivet som visas till vänster

karakterisering av ett ternärt komplex av eDHFR

slutligen, i en eDHFR: FH2:NADP (H) ternärt komplex med både samrenad endogen ligand och kofaktorer (Fig. 10), fann vi att Met20-slingan blir störd. Detta stöder rollen som kofaktorbindning för att förbättra konformationsprovtagning för snabb ligandutbyte eller underlätta produktfrisättning via en allosterisk mekanism (TS 2, Fig. 1)12,13,14,15. Nikotinamidribosdelen svänger bort från den aktiva platsen (Fig. 10) liknar det ockluderade FH4 ternära komplexet12. Dess redoxtillstånd är okänt baserat på elektrondensiteten. Förmågan att isolera olika endogena ligandbundna, binära och ternära eDHFR-komplex i varierande kristalliseringsbetingelser antyder att eDHFR innehåller en blandning av molekylära arter med olika bundna ligander och en ensemble av konformationer. Effektiviteten av det kristallografiska tillvägagångssättet som tillämpas här utnyttjar den molekylära inhomogeniteten genom att utelämna dialyssteget för att isolera en långvarig och kemiskt labil FH4-komplex kristallstruktur. Detta motsätter sig den typiska processen som involverar förbehandling av DHFR-prover genom dialys, vilket tar bort spår endogena ligander och ökar provhomogeniteten. Förbättrad homogenitet förbättrar i allmänhet den totala framgångsgraden för samkristallisering eller kristallblötnings experiment, när liganderna av intresse introduceras exogent.

Stereovyer av DHFR:FH2: NADP(H) ternära komplex. Den oordnade Met20-slingan (rester mellan Ile14 och Pro21) indikeras som svarta streckade linjer. Fo-Fc utelämningskartan på en 3,0 xnumx-nivå visas som rött nät. Sekundära strukturer visas som karikatyrerna och ligander i en pinne representation. Atomer är färgade enligt följande: kol (vit), kväve( blå), syre( röd) och fosfor (orange)