tidlös TCID50: en lösning på många virus
den här månaden täcker vi en gammal klassiker, vävnadsodling infektiös dos 50 analys, eller TCID50. Tcid50-analysen används för att kvantifiera virustitrar genom att bestämma koncentrationen vid vilken 50% av de infekterade cellerna uppvisar cytopatisk effekt (CPE). Så länge viruset av intresse orsakar celldöd, har denna analys fördelen att den är billig och lätt att implementera även när virusspecifika antikroppar inte är tillgängliga. Faktum är att mycket lite information om själva viruset krävs, vilket gör det till ett viktigt verktyg för att studera nya och framväxande patogener.
tcid50-analys: vad det är och hur man använder det
i en tcid50-analys läggs seriella utspädningar av ett virus på monolager av celler och lämnas tills CPE kan ses. Vid denna tidpunkt kan effekten av seriell utspädning på cellerna göras antingen på ett diskontinuerligt eller kontinuerligt sätt. På ett diskontinuerligt sätt används den enda utspädning vid vilken 50% av cellerna visar CPE för att ungefär kvantifiera mängden virus som finns i det ursprungliga beståndet. Detta är ganska enkelt och kräver ingen ytterligare analys. Men det kommer också med en viss felaktighet, eftersom det inte tillåter att exakt skilja inom samma utspädning.
mer exakt information kan uppnås på ett kontinuerligt sätt genom att använda en kolorimetrisk avläsning, t. ex. ett metaboliskt substrat med specifik absorbans, där mängden signal som förvärvas är proportionell mot antalet levande celler. Absorbansvärdena för de olika utspädningarna kan sedan plottas i en kontinuerlig icke-linjär regression dos-responskurva, från vilken det kommer att vara möjligt att extrapolera mer exakta TC50-värden. Den diskontinuerliga metoden är tillräcklig om en exakt titer inte krävs eller för att bestämma vilken koncentration av virus som behövs för att erhålla en viss procentandel av infektion i nedströmsanalyser (en fördel med TCID50 är att den kan utföras på cellinjen av intresse, så länge viruset orsakar CPE). Men även i dessa fall kan det vara bättre att använda utspädningsveck mellan 1:2 och 1:5 för att förbättra noggrannheten. När istället en mer exakt kvantifiering är nödvändig, till exempel när man jämför effekten av olika behandlingar eller mutationer på virustitrar, kan en kolorimetrisk metod föredras.
från utspädningar till titrar
tcid50-värden ger en indikation på hur mycket virus som behövs för att ha CPE i 50% av cellerna. Men hur går man från detta till den faktiska mängden virus per ml? Formeln är ganska enkel och består i att multiplicera tcid50-värdet med 0,7. Detta kommer från poissonfördelningen applicerad på virusinfektion som säger att sannolikheten för att nå 50% infektion uppnås i en fullständigt permissiv cellinje genom en mångfald infektion på cirka 0,7. Detta är inte alltid sant, men det är en bra approximation för de flesta tillämpningar.
problemen med att räkna virus
så exakt som man kan vara är det aldrig lätt att räkna virus. För det första är seriella utspädningar-av sin egen natur – en felkälla. För det andra – och detta är särskilt relevant för höga titer av virus-även den minsta volymen som förblir fäst vid slutet av en pipettspets kan bära tillräckligt med viruspartiklar för att göra en väsentlig skillnad i kvantifieringen. För det tredje är den biologiska variationen i systemet hög. Platta samma mängd celler, tillsätt samma mängd virus, stoppa infektionen samtidigt, och andelen infektion kan vara nära, men aldrig exakt densamma.
slutligen, när man bedömer en behandling som (som du hoppas!) minskar virustitrar, mängden virus kan falla under tröskelvärdet för analysdetektering.
konsten att räkna virus
den goda nyheten är att när du väl vet dina problem är du inte långt ifrån en lösning! Noggrannhet i seriell utspädning kan minskas genom automatisering, men även när detta inte är tillgängligt kan några små tips göra skillnaden. Dessa inkluderar byte av pipettspetsar och för aldrig in en pipettspets djupare än en millimeter i nästa utspädning, för att undvika att oavsiktligt överföra några extra virusloggar som bara fastnade på den yttre plasten. Replikat är också viktigt, och ju mer så för miniatyriserade analyser. 96 brunnsplattor möjliggör samtidig hantering av flera prover på ett sätt som mer låggenomströmningsmetoder (som plackanalys) inte skulle tillåta, men de kommer med ytterligare variation, eftersom små volymer är ännu mer känsliga för de frågor som diskuterats ovan. Medan tekniska replikat går något för att ta itu med detta, försöker vi på VRS att köra experiment som kräver en kolorimetrisk TCID50 i biologisk triplikat. Detta ökar robustheten i tillvägagångssättet och gör det möjligt att utesluta falska punkter i datasetet utan att förlora betydelse. Exakta TC50-värden kräver ett icke-linjärt regressionsdosrespons av kolorimetriska data, vilka program som GraphPad Prism enkelt kan generera. Möjligheten för någon programvara att plotta denna typ av kurva beror dock strikt på datakvaliteten och på de nära numeriska värdena för replikaten. En visuell inspektion av kurvorna och de genererade TC50-värdena rekommenderas starkt för att korrigera situationer där extrapoleringen har skett av falska datapunkter. Framför allt tyder vår erfarenhet på att utöver vanliga virusbeståndstitreringar kan experiment som kräver tcid50-avläsning behöva ytterligare optimeringssteg, både för att bestämma de bästa biologiska förhållandena som säkerställer uppströms insamling av reproducerbara mängder virus (t. ex. av infektion, tidpunkter) och det bästa koncentrationsintervallet för att testa på tcid50-analysen (t.ex. startkoncentration och utspädningsveck).
celldöd eller fina bilder?
att räkna döda celler är inte lätt, eftersom de ofta överger plattan vid första tvätten – antas att de fortfarande är där i första hand! Detta hjälper inte med noggrannhet. Även om det är dyrare och mödosamt, när en bra antikropp är tillgänglig, är immunofluorescensfärgning det tillvägagångssätt som vi i allmänhet skulle välja. Analysen kan stoppas före celldöd och känsligheten är i allmänhet högre, vilket möjliggör mer kontroll och högre noggrannhet. Dessutom kan denna metod användas för virus som inte orsakar CPE, eller som tar lång tid att göra det (och låt oss möta det, några fina bilder av ett virus i aktion är mycket mer upplyftande!). Cellskador är dock varumärket för de flesta infektioner och för flera nya virus som vi vet väldigt lite om. Flera kolorimetriska / fluorescerande reportrar är nu tillgängliga för att noggrant mäta och skilja mellan olika typer av cytotoxicitet. Det ser ut som denna gamla klassiker är upp för nya utmaningar!