5.3 Regulación mediada por miARN de Dianas
Dentro del RISC, el miARN interactúa con los genes diana a través del emparejamiento de bases. La interacción entre un miARN y su ARNm objetivo está restringida al extremo 5′ del miARN. La complementariedad de secuencias entre nucleótidos 2-8, también conocida como la «región semilla», es vital para el reconocimiento de secuencias objetivo , aunque se han demostrado excepciones a esta regla . Más comúnmente, los sitios de unión de miRNA están presentes en la región 3’sin traducir (UTR) de los ARNm objetivo, generalmente en múltiples copias . Sin embargo, también se ha demostrado que el miRNA se dirige a las regiones 5′-UTR y codificantes del ARNm . Un estudio de Tay et al. se demostró que una red de miARN puede unirse a múltiples sitios dentro de la codificación y 3′-UTR de un único objetivo de ARNm, lo que aumenta la complejidad de la regulación del objetivo mediada por miARN . El grado de complementariedad entre la región semilla del miARN y el sitio de unión en el ARNm objetivo determina el mecanismo por el cual el miARN regula el objetivo . Si el miARN muestra suficiente complementariedad de secuencia (casi perfecta) con el ARNm objetivo, entonces la regulación se lleva a cabo mediante un proceso llamado interferencia de ARN, por el cual el RISC se dirige a escindir el ARNM objetivo . Si la complementariedad es insuficiente, como ocurre generalmente en los mamíferos , la regulación se logra mediante la represión de la traducción y/o desestabilización del ARNm .
Los componentes principales del RISC son la familia de proteínas Argonaute (Ago), que desempeñan un papel clave en su función . Las cuatro proteínas de Ago de mamíferos (Ago1-Ago4) pueden dirigir la represión traslacional de un ARNm objetivo, sin embargo, solo la Ago2 posee actividad «cortadora», y es responsable de escindir el ARNm objetivo . El mecanismo(s) exacto (s) de la represión translacional mediada por miARN de los genes diana es todavía incierto . Varios estudios han proporcionado evidencia de que la represión de la traducción ocurre antes del inicio de la traducción . Sin embargo, otros estudios sugieren que la represión ocurre después del inicio de la traducción . Inicialmente se pensó que la represión mediada por miARN de los genes diana se reflejaba predominantemente a nivel de proteínas, con un efecto nulo o mínimo en los niveles de ARNm. Sin embargo, ahora se ha demostrado que la represión mediada por miARN de los genes diana se asocia con frecuencia con la desestabilización del ARNm, aunque no se sabe si este es un efecto secundario de la represión traslacional. La degradación mediada por miARN de los objetivos de ARNm implica la deadenilación (eliminación de la cola Poli A), seguida de decapado y digestión exonucleolítica . Además, se cree que los cuerpos de procesamiento (cuerpos P), estructuras citoplasmáticas involucradas en el almacenamiento y la degradación del ARNm, también desempeñan un papel en la regulación del miRNA . Se cree que los miRNA guían el ARNm diana y las proteínas RISC asociadas a estas estructuras de almacenamiento, que están enriquecidas para la degradación del ARNm y los factores de represión traslacional . Los mecanismos que dictan si un ARNm objetivo sigue la vía de degradación o represión traslacional son actualmente desconocidos. A la complejidad de la regulación mediada por miARN se suman los recientes descubrimientos de que, bajo diferentes condiciones de estrés, la represión inducida por miARN de objetivos puede revertirse y que el miARN puede activar la traducción del ARNm objetivo .
La regulación mediada por miARN parece ser un proceso extremadamente dinámico, su complejidad aumenta por el hecho de que no se requiere una complementariedad perfecta con el objetivo para la regulación. Esto indica que un solo miARN tiene el potencial de regular múltiples genes diana. Además, una red de miRNA puede funcionar simultáneamente para regular un solo ARNm. Esto, en última instancia, hace que la identificación in silico de los genes diana y la elucidación de la función del miARN sea mucho más difícil.
La región semilla, ubicada en las posiciones 2-7 del extremo 5′ del miARN, es empleada por el RISC como una señal de nucleación para reconocer el ARNm objetivo . En el ARNm, los sitios correspondientes se denominan «sitios de semillas». Hay una serie de restricciones asociadas con el reconocimiento y enlace del sitio semilla de destino . Un sitio de semillas riguroso tiene una unión perfecta de Watson-Crick y se puede dividir en cuatro tipos de «semillas»: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 y 6mer . Cada uno de estos tipos difiere dependiendo de la combinación del nucleótido de la posición 1 y el emparejamiento en la posición 8. 8mer tiene tanto una adenina en la posición 1 del sitio objetivo del ARNm como un emparejamiento de bases en la posición 8. Se sabe que una adenina en el sitio objetivo correspondiente a la posición 1 de un miARN aumenta la eficiencia del reconocimiento del objetivo . 7mer-A1 tiene una adenina solo en la posición 1, mientras que 7mer-m8 tiene emparejamiento de bases solo en la posición 8. Por el contrario, 6mer no tiene adenina en la posición 1 ni emparejamiento de bases en la posición 8 .
Además del estricto reconocimiento de semillas, también es posible un reconocimiento moderadamente estricto, ya que el RISC puede tolerar pequeños desajustes o emparejamientos de oscilación dentro de la región de semillas. La estabilidad termodinámica de un emparejamiento de oscilación (como G:U) es comparable a la de un emparejamiento Watson–Crick .
Se sabe que el emparejamiento Watson–Crick en la parte 3′ de la molécula de miRNA mejora la eficacia de reconocimiento de sitios en dianas de miRNA que tienen emparejamiento de semillas . El número de nucleótidos preferibles de coincidencias en la parte 3′ difiere entre el sitio que tiene emparejamiento de semillas estrictas y el que tiene emparejamiento de semillas moderadamente estrictas . Las semillas estrictas requieren 3-4 partidos en las posiciones 13-16, mientras que las semillas moderadas-estrictas requieren 4-5 partidos en las posiciones 13-19. Los sitios con este emparejamiento adicional de 3′ se denominan sitios complementarios de 3 y compensatorios de 3′.
Se ha demostrado ampliamente que la gran mayoría de las secuencias de reconocimiento de miRNA diana se encuentran en el 3′-UTR del gen diana, a pesar de que el RISC cargado con miRNA puede, en teoría, unirse a cualquier segmento de ARNm. Los genes diana generalmente tienen una UTR de 3′ más larga, mientras que ciertos genes ubicuos, como los genes de mantenimiento doméstico, tienden a tener una UTR de 3′ más corta, potencialmente para evitar ser regulados por el miARN . Los sitios objetivo no están distribuidos uniformemente con 3′ UTR. Se encuentran cerca de ambos extremos en long 3 ‘ UTR (generalmente ≥2000 nt). Para UTR de 3’ más cortos, los sitios objetivo tienden a estar a ~15-20 nt del codón de parada .
Mientras que generalmente se considera que los sitios de miRNA funcionales se ubican preferentemente en 3′ UTR, los sitios de semilla en la secuencia de codificación y las regiones 5′ UTR también pueden promover la regulación descendente del ARNm . La base para la unión preferencial de miARN en el UTR de 3′ puede tener una serie de explicaciones. Por ejemplo, el RISC puede tener que competir con otros complejos de proteínas, como los ribosomas, que se unen a la secuencia de codificación y los complejos de iniciación de traducción en el 5′ UTR. Como tal, la UTR de 3′ podría ser simplemente más accesible para enlaces a largo plazo que los otros dos sitios .