Zvýšená Exprese mRNA PEPCK
cytosolickou izoformu PEPCK je primární místo nařízení z obou jaterní a renální glukoneogeneze (71). Tato aktivita však není regulována alosterickými mechanismy nebo kovalentními modifikacemi. Místo toho je regulována pouze mechanismy, které určují hladinu pepck mRNA a tím kontrolují hladinu pepck proteinu. Toho je dosaženo změnami rychlosti syntézy nebo rychlosti degradace mRNA PEPCK. Gen PCK1, který kóduje cytosolický PEPCK, se skládá z 10 exonů a 9 intronů a má délku přibližně 6 kb (13). To kóduje jeden 2.6 kb mRNA, která je přeložena do proteinu, který obsahuje 621 aminokyselin a má hmotnost 69,300 Da. Hladina mRNA PEPCK v ledvinách potkanů se rychle zvyšuje po akutním nástupu acidózy (80). Zvýšení je zahájeno do 1 hodiny a dosahuje maxima do 7 hodin na úrovni, která je šestkrát vyšší než obvykle. Transkripční run off experimenty (80) ukázaly, že změny v relativní rychlosti transkripce genu PCK1 představují počáteční indukci PEPCK mRNA. Kromě toho, pozorované změny v mRNA PEPCK úzce souvisí s předchozími údaji, které měří změny v relativní míra PEPCK syntézu bílkovin v normální a acidotickou potkanů (84). Nicméně, šestinásobně vyvolané úrovni mRNA PEPCK je trvalé u potkanů, které jsou vyrobeny chronicky acidotickou i když relativní míru transkripce se postupně snižuje a plošiny na úrovni, která je jen dvojí větší, než bylo pozorováno v normální krysy (81).
Různé segmenty promotoru PEPCK, stejně jako core promotor (-460 do +73 bp) obsahující zvláštní blok mutace v regulační prvky byly podrobně analyzovány v transgenních zvířat, určit jejich roli v kontrole PCK1 genové exprese (72). Promotor jádra wildtypu fúzovaný s genem bovinního růstového hormonu (bGH) obsahuje všechny informace nezbytné k zajištění odpovídající exprese a hormonální regulace v játrech. Větší 2, 3 kb segment promotoru PEPCK byl nutný k řízení exprese transgenu v tukové tkáni. Obě tyto konstrukce však byly vyjádřeny na nízkých hladinách v ledvinách. V kontrastu, CRC362 transgenu, která obsahuje pouze 362 bp promotoru ale všechny následné exonů a intronů krysy PCK1 gen byl vyjádřen na normální úrovni v ledvinách (40). Tento transgenu liší od endogenního genu pouze nahrazení segmentu kuřecí PCK1 genu do části poslední exon, který kóduje 3′-UTR z mRNA PEPCK. Kromě toho tato konstrukce vykazuje významnou renální specifickou indukci, když byly transgenní myši vyrobeny acidoticky (20).
LLC-PK1-F + buňky vykazují indukci PEPCK mRNA reagující na pH (64). Předchozí pokusy o identifikaci pH-responzivní element přechodné expresi různých PEPCK-chloramfenikol acetyltransferázu reportér konstrukty v LLC-PK1-F+ buňky produkované rozporuplné výsledky (21, 77). Tyto studie však jasně stanoveno, že vazba HNF-1 P2 prvek je zásadní pro bazální exprese ledvin PEPCK a že tento protein:DNA interakce může přispět k zvýšené expresi během acidózy. Luciferase konstrukty obsahující buď 490 nebo 2300 bp promotoru PEPCK jsou silně aktivovány cotransfection LLC-PK1-F+ buňky s katalytické podjednotky protein kinázy A (112). Nicméně, ani postavit vykazuje zvýšenou aktivitu, když transfektovaly buňky byly převedeny do kyselém prostředí (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (Wall Q et al., nepublikovaná data, 1999). Toto pozorování a zjištění, že transgenu obsahující pouze 362 bp promotoru spolu s navazujícím exonů a intronů je dostačující rekapitulovat pH-responzivní indukce (20) naznačují, že PEPCK gen může obsahovat následný prvek, který je nezbytný pro pH-responzivní zvýšení transkripce. Další experimenty prokázaly, že C/EBPß (112) a ATF-2 (44) se váží na prvek CRE-1 genu PEPCK v ledvinách.
předchozí studie také prokázaly, že poločas mRNA PEPCK je zvýšen v játrech v reakci na cAMP (76) a glukokortikoidy (132). Zvýšená stabilita může také přispět k trvalé indukci renální PEPCK mRNA během chronické acidózy (81). Proto selektivní stabilizace mRNA může také hrát důležitou roli ve fyziologické regulaci exprese genu PEPCK. Promotorový systém reagující na tetracyklin byl použit ke kvantifikaci poločasu různých chimérických mRNA β-globin-PEPCK (ßG-PCK)v buňkách LLC-PK1-F+ (67).
mRNA ßG-PCK-1, která obsahuje celou 3′ – UTR PEPCKOVY mRNA, byla degradována s poločasem 1,2 hodiny. Léčba rnázou H ukázala, že k rychlé deadenylaci došlo současně s degradací ßG-PCK-1 mRNA. Předchozí studie (108) ukázaly, že PCK-7, 50-NT segment na 3′-konci 3′-UTR, váže neidentifikovaný protein, který může přispět k rychlému rozpadu PEPCK mRNA. Chimérická mRNA ßG-PCK-7 má však poločas 17 hodin. Zahrnutí sousedního segmentu PCK-6, oblasti bohaté na 23 bp AU, vytvořilo ßG-PCK-6/7 mRNA, která má poločas 3,6 hodiny. MRNA ßG-PCK-3, která obsahuje 3 ‚- polovinu 3 ‚ – UTR, byla degradována se stejným poločasem rozpadu. Překvapivě byla mRNA ßG-PCK-2, která obsahuje 5 ‚- konec 3 ‚ – UTR, také rychle degradována (t1 / 2 = 5, 4 hodiny). Analýzy RNA gel-shift prokázaly, že auf1 se váže na segmenty PCK-7, PCK-6 a PCK-2 s vysokou afinitou a specificitou. Mutační analýza ukazuje, že AUF1 se váže na sekvenci uuau-UUUAU v rámci PCK-6 a strukturu kmenové smyčky a sousední CU-oblast PCK-7. AUF1 se tedy váže na více destabilizujících prvků v rámci 3 ‚ – UTR, které se podílejí na rychlém obratu mRNA PEPCK. Nedávné experimenty ukazují, že PCK-7 segment se také váže ζ-crystallin/NADPH: chinon reduktázy s vysokou afinitou a specificitou (Hajarnis a Curthoys, nepublikované údaje, 2006). Stejný mechanismus, který představuje postupnější indukci mRNA GA a GDH, může také přispět k trvalému zvyšování hladin mRNA PEPCK během chronické acidózy.