zwiększona ekspresja mRNA PEPCK
izoforma CYTOZOLOWA PEPCK jest głównym miejscem regulacji glukoneogenezy zarówno wątrobowej, jak i nerkowej (71). Aktywność ta nie jest jednak regulowana przez mechanizmy allosteryczne ani przez modyfikacje kowalencyjne. Zamiast tego jest regulowany wyłącznie przez mechanizmy, które określają poziom PEPCK mRNA i tym samym kontrolują poziom białka PEPCK. Osiąga się to poprzez zmiany szybkości syntezy lub szybkości degradacji PEPCK mRNA. Gen PCK1 kodujący PEPCK cytozolowy składa się z 10 eksonów i 9 intronów i ma długość około 6 kb (13). Koduje pojedynczy 2,6-kb mRNA, który jest tłumaczony na białko, które zawiera 621 aminokwasów i ma masę 69 300 Da. Poziom PEPCK mRNA w nerkach szczura gwałtownie wzrasta po ostrym wystąpieniu kwasicy (80). Wzrost rozpoczyna się w ciągu 1 godziny i osiąga maksimum w ciągu 7 godzin na poziomie sześciokrotnie większym niż normalnie. Eksperymenty z zakończeniem transkrypcji (80) wykazały, że zmiany względnej szybkości transkrypcji genu PCK1 odpowiadają za początkową indukcję mRNA PEPCKA. Ponadto obserwowane zmiany poziomów mRNA PEPCK były ściśle skorelowane z wcześniejszymi danymi mierzącymi zmiany względnego tempa syntezy białek PEPCK u zdrowych i kwasowych szczurów (84). Jednakże sześciokrotny indukowany poziom PEPCK mRNA utrzymuje się u szczurów, które są przewlekle kwasowe, mimo że względna szybkość transkrypcji stopniowo maleje i płaskostopie na poziomie, który jest tylko dwukrotnie większy niż obserwowany u normalnych szczurów (81).
różne segmenty promotora PEPCK, jak również promotor rdzenia (-460 do +73 bp) zawierające specyficzne mutacje blokowe w elementach regulacyjnych zostały szeroko przeanalizowane u zwierząt transgenicznych w celu określenia ich roli w kontrolowaniu ekspresji genu PCK1 (72). Promotor rdzenia typu dzikiego połączony z genem bydlęcego hormonu wzrostu (bGH) zawiera wszystkie informacje niezbędne do zapewnienia odpowiedniej ekspresji i regulacji hormonalnej w wątrobie. Do napędzania ekspresji transgenu w tkance tłuszczowej potrzebny był większy segment promotora PEPCK o rozmiarze 2,3 kb. Jednak oba te konstrukty były wyrażane na niskim poziomie w nerkach. Natomiast transgen CRC362 zawierający tylko 362 bp promotora, ale wszystkie późniejsze eksony i introny szczurzego genu PCK1 ulegały ekspresji na prawidłowym poziomie w nerkach (40). Transgen ten różnił się od endogennego genu jedynie przez podstawienie segmentu genu pck1 kurzego do części końcowego egzonu kodującego 3 ’ – UTR pepck mRNA. Co więcej, Ta ostatnia konstrukcja wykazuje znaczną indukcję specyficzną dla nerek, gdy transgeniczne myszy stały się kwasowe (20).
komórki LLC-PK1-F+ wykazują reagującą na pH indukcję PEPCK mRNA (64). Wcześniejsze próby identyfikacji elementu reagującego na pH przez przemijającą ekspresję różnych konstrukcji reporterowych acetylotransferazy PEPCK-chloramfenikolowej w komórkach LLC-PK1-F+ przyniosły sprzeczne wyniki (21, 77). Jednakże badania te wyraźnie wykazały, że Wiązanie HNF-1 z pierwiastkiem P2 jest niezbędne do podstawowej ekspresji pepku nerkowego i że interakcja białka z DNA może przyczyniać się do zwiększonej ekspresji podczas kwasicy. Konstrukty lucyferazy zawierające 490 lub 2300 bp promotora PEPCK są silnie aktywowane przez kot-fekcję komórek LLC-PK1-F+ z podjednostką katalityczną kinazy białkowej a (112). Jednak żadna z konstrukcji nie wykazuje zwiększonej aktywności, gdy transfekowane komórki zostały przeniesione do kwaśnego podłoża (pH 6,9, 10 mM HCO-3) (Wall Q et al., niepublikowane dane, 1999). Ta obserwacja i stwierdzenie, że transgen zawierający tylko 362 bp promotora wraz z eksonami i intronami w dalszej kolejności wystarczają do rekapitulacji indukcji reagującej na pH (20) sugerują, że Gen PEPCK może zawierać element w dalszej kolejności, który jest niezbędny do wzrostu transkrypcji reagującej na Ph. Inne eksperymenty wykazały, że C/EBPß (112) i ATF-2 (44) wiążą się z elementem Cre-1 genu PEPCK w nerkach.
poprzednie badania wykazały również, że okres półtrwania mRNA PEPCK jest wydłużony w wątrobie w odpowiedzi na cAMP (76) i glikokortykosteroidy (132). Zwiększona stabilność może również przyczynić się do długotrwałego indukowania nerkowego PEPCK mRNA podczas przewlekłej kwasicy (81). Dlatego selektywna stabilizacja mRNA może również odgrywać ważną rolę w fizjologicznej regulacji ekspresji genu PEPCK. System promotorów reagujących na tetracykliny został użyty do ilościowego określenia okresu półtrwania różnych chimerycznych mRNA β-globin-PEPCK (ßG-PCK) w komórkach LLC-PK1-F+ (67).
ßG-PCK-1 mRNA, który zawiera cały 3 ’ – UTR mRNA PEPCK, został zdegradowany z okresem półtrwania wynoszącym 1,2 godziny. Leczenie rnazą H wskazywało na szybką deadenylację w połączeniu z degradacją mRNA ßG-PCK-1. Wcześniejsze badania (108) wykazały, że PCK-7, segment 50-nt na 3′-końcu 3′-UTR, wiąże niezidentyfikowane białko, które może przyczyniać się do szybkiego rozpadu PEPCK mRNA. Jednak chimeryczny ßG-PCK-7 mRNA ma okres półtrwania 17 godzin. Włączenie sąsiedniego segmentu PCK-6, region bogaty w AU 23-bp, wytworzyło ßG-PCK-6/7 mRNA, którego okres półtrwania wynosi 3,6 godziny. MRNA ßG-PCK-3, który zawiera 3 ’- połowę 3 ’ – UTR, ulegał degradacji z tym samym okresem półtrwania. Co zaskakujące, ßG-PCK-2 mRNA, który zawiera 5′-koniec 3 ’ – UTR, również ulegał szybkiej degradacji (t1/2 = 5,4 godziny). Analizy przesunięcia żelu RNA wykazały, że auf1 wiąże się z segmentami PCK-7, PCK-6 i PCK-2 z wysokim powinowactwem i swoistością. Analiza mutacyjna wskazuje, że auf1 wiąże się z sekwencją UUAU-UUUAU w obrębie PCK-6 oraz strukturą pętli macierzystej i sąsiednim regionem CU PCK-7. W ten sposób auf1 wiąże się z wieloma destabilizującymi elementami w 3′ -UTR, które uczestniczą w szybkim obrocie PEPCK mRNA. Nowsze eksperymenty wskazują, że segment PCK-7 wiąże również reduktazę ζ-crystallin/NADPH: chinone z wysokim powinowactwem i swoistością (Hajarnis i Curthoys, niepublikowane dane, 2006). Tak więc ten sam mechanizm, który odpowiada za bardziej stopniowe indukowanie mRNA GA i GDH, może również przyczynić się do trwałego wzrostu poziomu mRNA PEPCK podczas przewlekłej kwasicy.