expressão aumentada de PEPCK mRNA
a isoforma citosólica de PEPC é um local primário de regulação da gluconeogénese hepática e renal (71). No entanto, esta actividade não é regulada por mecanismos alostéricos ou por modificações covalentes. Em vez disso, é regulada apenas por mecanismos que determinam o nível do mRNA PEPCK e, assim, controlam o nível da proteína PEPCK. Isto é conseguido através de mudanças na taxa de síntese ou na taxa de degradação do mRNA PEPCK. O gene PCK1 que codifica o PEPCK citosólico é composto por 10 exons e 9 introns e tem aproximadamente 6 kb de comprimento (13). Ele codifica um único mRNA de 2,6 kb que é traduzido em uma proteína que contém 621 aminoácidos e tem uma massa de 69.300 Da. O nível de ARNm PEPCK no rim do rato aumenta rapidamente após o aparecimento agudo de acidose (80). O aumento é iniciado dentro de 1 hora e atinge um máximo dentro de 7 horas a um nível que é seis vezes maior do que o normal. A transcrição dos experimentos (80) indicaram que as alterações na taxa relativa de transcrição do gene PCK1 explicam a indução inicial do mRNA de PEPCK. Além disso, as alterações observadas nos níveis de mRNA PEPCK correlacionaram-se estreitamente com dados anteriores que mediram alterações nas taxas relativas da síntese das proteínas PEPC em ratos normais e acidóticos (84). No entanto, o nível seis vezes induzido de ARNm PEPCK mantém-se em ratos que são cronicamente acidóticos, apesar da taxa relativa de transcrição diminuir gradualmente e do Planalto a um nível que é apenas duas vezes maior do que o observado em ratos normais (81).
vários segmentos do promotor PEPCK, bem como o promotor Central (-460 a +73 bp) contendo mutações específicas de bloco em elementos regulamentares, foram extensivamente analisados em animais transgénicos para determinar o seu papel no controlo da expressão do gene PCK1 (72). O promotor do núcleo do tipo selvagem fundido ao gene da hormona de crescimento bovina (bGH) contém todas as informações necessárias para assegurar a expressão e regulação hormonal adequadas no fígado. Um segmento maior de 2,3 kb do promotor PEPCK era necessário para conduzir a expressão do transgeno em tecido adiposo. No entanto, ambas as construções foram expressas em baixos níveis no rim. Em contrapartida, um CRC362 transgeno que contém apenas 362 bp do promotor, mas todos os exões e intrões a jusante do gene PCK1 do rato foi expresso a níveis normais no rim (40). Este transgeno diferia do gene endógeno apenas pela substituição de um segmento do gene PCK1 de galinha na porção do exon final que codifica o 3′-UTR do mRNA PEPCK. Além disso, esta última construção apresenta uma indução renal específica significativa quando os ratinhos transgénicos foram acidóticos (20).
as células LLC-PK1-F + apresentam uma indução que responde ao pH do mRNA PEPCK (64). Tentativas anteriores de identificar um elemento sensível ao pH por expressão transitória de várias construções de repórter acetiltransferase PEPCK-cloranfenicol em células LLC-PK1 – F + produziram resultados contraditórios (21, 77). No entanto, estes estudos estabeleceram claramente que a ligação do HNF-1 ao elemento P2 é essencial para a expressão basal do PEPC renal e que esta proteína:a interacção do ADN pode contribuir para o aumento da expressão durante a acidose. As construções de Luciferase que contenham 490 ou 2300 bp do promotor PESCK são fortemente activadas por cotransfecção de células LLC-PK1-F+ com a subunidade catalítica da proteína cinase a (112). No entanto, nenhuma das construções exibe um aumento de actividade quando as células transferidas foram transferidas para o meio ácido (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (Wall Q et al., unpublished data, 1999). Esta observação e a constatação de que um transgene contendo apenas 362 bp do promotor, juntamente com o de jusante éxons e íntrons é suficiente para recapitular o pH-sensíveis de indução (20) sugerem que o gene da PEPCK pode conter de uma a jusante do elemento que é essencial para o pH-sensíveis aumento da transcrição. Outros experimentos estabeleceram que C/EBPß (112) e ATF-2 (44) se ligam ao elemento CRE-1 do gene PEPCK no rim.
estudos anteriores demonstraram também que a semi-vida do mRNA PÉPCK é aumentada no fígado em resposta aos cAMP (76) e glucocorticóides (132). O aumento da estabilidade pode também contribuir para a indução sustentada de ARNm da PEPC renal durante a acidose crónica (81). Portanto, a estabilização seletiva do ARNm também pode desempenhar um papel importante na regulação fisiológica da expressão do gene PEPCK. O sistema promotor sensível à tetraciclina foi utilizado para quantificar a semi-vida de várias células quiméricas de β-globina-PEPC (ßG-PCK) de mRNAs em células LLC-PK1-F+ (67).
o mRNA ßG-PCK-1, que contém a totalidade de 3′-UTR do mRNA PEPCK, foi degradado com uma semi-vida de 1,2 horas. O tratamento com RNase H indicou que ocorreu uma mortenilação rápida concomitante com a degradação do arnb ßG-PCK-1. Estudos anteriores (108) indicaram que o PCK-7, um segmento de 50-nt na extremidade 3’do 3′-UTR, se liga a uma proteína não identificada que pode contribuir para o rápido decaimento do mRNA PEPCK. No entanto, o ARNm ßG-PCK-7 quimérico tem uma semi-vida de 17 horas. A inclusão do segmento adjacente do PCK-6, uma região rica em AU-bp 23, produziu o mRNA ßG-PCK-6/7 que tem uma semi-vida de 3,6 horas. O ARNm ßG-PCK-3 que contém a 3′-metade de 3′-UTR foi degradado com a mesma semi-vida. Surpreendentemente, o Rnam ßG-PCK-2, que contém o 5′-end do 3′-UTR, também foi degradado rapidamente (t1/2 = 5,4 horas). A análise do gel-shift ARN estabeleceu que o AUF1 se liga aos segmentos PCK-7, PCK-6 e PCK-2 com elevada afinidade e especificidade. A análise mutacional indica que o AUF1 se liga a uma sequência UUAU-UUUAU dentro do PCK-6 e uma estrutura de ciclo-tronco e Região CU adjacente do PCK-7. Assim, a AUF1 liga-se a vários elementos desestabilizadores dentro da 3′ – UTR que participam no rápido volume de negócios do mRNA PEPCK. Experimentos mais recentes indicam que o segmento PCK-7 também se liga a ζ-cristalina/NADPH: quinona redutase com alta afinidade e especificidade (Hajarnis e Curtoys, dados não publicados, 2006). Assim, o mesmo mecanismo que contribui para a indução mais gradual dos mRNAs GA e GDH pode também contribuir para o aumento sustentado dos níveis de mRNA da PEPCK durante a acidose crónica.