versterkte expressie van PEPCK mRNA
de cytosolische isoform van PEPCK is een primaire plaats van regulatie van zowel hepatische als renale gluconeogenese (71). Nochtans, wordt deze activiteit niet geregeld door allosteric mechanismen of door covalente wijzigingen. In plaats daarvan, wordt het uitsluitend geregeld door mechanismen die het niveau van pepck mRNA bepalen en daardoor het niveau van de pepckproteã ne controleren. Dit wordt bereikt door veranderingen in of het tarief van synthese of het tarief van degradatie van pepck mRNA. Het pck1-gen dat de cytosolische PEPCK codeert, bestaat uit 10 exonen en 9 introns en is ongeveer 6 kb lang (13). Het codeert een enkele 2,6-kb mRNA die wordt vertaald in een eiwit dat 621 aminozuren bevat en een massa van 69.300 Da heeft. Het niveau van PEPCK mRNA in de rattennier neemt snel toe na acute acidose (80). De verhoging wordt gestart binnen 1 uur en bereikt een maximum binnen 7 uur op een niveau dat zes keer groter is dan normaal. De experimenten van de transcriptieuitloop (80) wezen erop dat de veranderingen in de relatieve snelheid van transcriptie van het gen pck1 voor de aanvankelijke inductie van pepck mRNA verantwoordelijk zijn. Bovendien correleerden de waargenomen veranderingen in het mRNA-gehalte van PEPCK nauw met eerdere gegevens die veranderingen in de relatieve percentages van de pepck-eiwitsynthese bij normale en acidotische ratten meetden (84). Nochtans, wordt het zesvoudige veroorzaakte niveau van pepck mRNA gehandhaafd in ratten die chronisch acidotic worden gemaakt hoewel het relatieve tarief van transcriptie geleidelijk en plateaus op een niveau afneemt dat slechts tweevoudig groter is dan waargenomen in normale ratten (81).
verschillende segmenten van de pepck-promotor, evenals de kernpromotor (-460 tot +73 bp) die specifieke blokmutaties in regulerende elementen bevatten, zijn uitgebreid geanalyseerd bij transgene dieren om hun rol in de controle van pck1-genexpressie te bepalen (72). De wildtype Core promotor gefuseerd met het bovine growth hormone (BGH) gen bevat alle informatie die nodig is om een passende expressie en hormonale regulatie in de lever te garanderen. Een groter 2.3 kb segment van de pepck promotor werd vereist om uitdrukking van transgen in vetweefsel te drijven. Echter, beide van deze constructen werden uitgedrukt op lage niveaus in de nier. Daarentegen werd een CRC362 transgeen dat slechts 362 bp van de promotor bevat, maar alle downstream exons en introns van het pck1-gen bij ratten op normale niveaus in de nier tot expressie gebracht (40). Dit transgen verschilde van het endogene gen slechts door de substitutie van een segment van het kippen pck1 gen in het gedeelte van het definitieve exon dat 3′-UTR van pepck mRNA codeert. Bovendien vertoont de laatste constructie een significante renale specifieke inductie wanneer de transgene muizen acidotisch werden gemaakt (20).
LLC-PK1-F + cellen vertonen een pH-responsieve inductie van PEPCK mRNA (64). Eerdere pogingen om een pH-responsief element te identificeren door tijdelijke expressie van verschillende PEPCK-chlooramfenicol acetyltransferase reporter-constructen in LLC-PK1-F+ cellen veroorzaakten tegenstrijdige resultaten (21,77). Deze studies hebben echter duidelijk aangetoond dat binding van HNF-1 Aan het P2-element essentieel is voor de basale expressie van de renale PEPCK en dat deze eiwit:DNA-interactie kan bijdragen tot verhoogde expressie tijdens acidose. Luciferaseconstructies die 490 of 2300 bp van de pepck-promotor bevatten, worden sterk geactiveerd door cotransfection van LLC-PK1-F+ cellen met de katalytische subeenheid van eiwitkinase A (112). Echter, geen van beide constructen vertoont een verhoogde activiteit wanneer de getransfecteerde cellen werden overgebracht naar zuur medium (pH 6,9, 10 mM HCO-3) (Wall Q et al., ongepubliceerde gegevens, 1999). Deze observatie en de bevinding dat een transgen die slechts 362 bp van de promotor samen met de downstream exons en introns bevat voldoende is om de pH-responsieve inductie te recapituleren (20) suggereren dat het PEPCK-gen een downstream element kan bevatten dat essentieel is voor de pH-responsieve toename van transcriptie. Andere experimenten hebben aangetoond dat C / EBPß (112) en ATF-2 (44) binden aan het CRE-1-element van het pepck-gen in de nieren.Eerdere studies hebben ook aangetoond dat de halfwaardetijd van het mRNA van PEPCK verhoogd is in de lever als reactie op cAMP (76) en glucocorticoïden (132). Verhoogde stabiliteit kan ook bijdragen tot de aanhoudende inductie van renale pepck mRNA tijdens chronische acidose (81). Daarom kan de selectieve mRNA stabilisatie ook een belangrijke rol in de fysiologische verordening van pepck genuitdrukking spelen. Het tetracycline-responsieve promotorsysteem werd gebruikt om de halfwaardetijd van diverse chimerische β-globine-PEPCK (ßG-PCK) mRNAs in LLC-PK1-F+ cellen (67) te kwantificeren.
het ßG-PCK – 1 mRNA, dat de volledige 3′-UTR van het pepck mRNA bevat, werd afgebroken met een halfwaardetijd van 1,2 uur. Behandeling met RNase H gaf aan dat snelle deadenylering gelijktijdig met afbraak van de ßG-PCK-1 mRNA optrad. Uit eerdere studies (108) bleek dat PCK-7, een 50-nt segment aan het 3′-einde van de 3′-UTR, een niet-geïdentificeerd eiwit bindt dat kan bijdragen aan het snelle verval van de mRNA PEPCK. Nochtans, heeft chimeric ßG-PCK-7 mRNA een halveringstijd van 17 uren. Het opnemen van het aangrenzende segment PCK-6, Een 23-bp AU-rijke regio, produceerde de ßG-PCK-6/7 mRNA die een halveringstijd van 3,6 uur heeft. De ßG-PCK – 3 mRNA die de 3′-helft van 3′-UTR bevat werd gedegradeerd met dezelfde halfwaardetijd. Verrassend genoeg werd ook de ßG-PCK-2 mRNA, die het 5′-einde van de 3′-UTR bevat, snel afgebroken (T1 / 2 = 5,4 uur). De analyses van de GEL-verschuiving van RNA stelden vast dat AUF1 aan de segmenten PCK-7, PCK-6, en PCK-2 met hoge affiniteit en specificiteit bindt. Mutatieanalyse geeft aan dat AUF1 zich bindt aan een uuau-uuuau-sequentie binnen PCK-6 en een stam-lusstructuur en aangrenzende CU-regio van PCK-7. Aldus, bindt AUF1 aan veelvoudige destabiliserende elementen binnen 3 ‘ – UTR die aan de snelle omzet van pepck mRNA deelnemen. Meer recente experimenten tonen aan dat het PCK-7 segment ook ζ-crystallin/NADPH bindt: quinone reductase met hoge affiniteit en specificiteit (Hajarnis and Curthoys, unpublished data, 2006). Zo kan hetzelfde mechanisme dat verantwoordelijk is voor de meer geleidelijke inductie van de ga en GDH mRNA ‘ s ook bijdragen aan de aanhoudende toename van de pepck mRNA-spiegels tijdens chronische acidose.