Molekulární Výrazy Microscopy Primer: Specializované Mikroskopie – Fluorescenční Digitální Galerie Obrázků – Madin-Darby Canine Kidney Epiteliální Buňky (MDCK)

Odvozené od S. H. Madin a N. B. Darby z ledvin tkáně dospělé samice kokršpaněl, MDCK buňky linie vznikla v září roku 1958. Od té doby byly buňky široce využívány ke zkoumání zpracování prekurzorového proteinu beta-amyloidu, stejně jako třídění jeho proteolytických produktů.

morfologie buněčné linii MDCK je epiteliální, buňky jsou pozitivní na keratin tím, že imunoperoxidázovými barvení. Viry, které MDCK buňky jsou náchylné k patří vezikulární stomatitida (Indiana kmen), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 a 3, adenovirus 4 a 5, vezikulární exantém prasat a infekční psí hepatitida. Buňky vykazují rezistenci na coxsackievirus B3 a B4, stejně jako poliovirus 2, a jsou negativní na reverzní transkriptázu.

linie MDCK se běžně používá jako obecný model pro epiteliální buňky, které zahrnují typ tkáně známý jako epitel. Hlavně pokrývající vnitřní orgány a jiné povrchy těla, epitel se skládá z pevně zabalené buňky, které jsou uspořádány do listů. Tyto buňky vylučují extracelulární matrici zvanou bazální lamina na jejich základně, která pomáhá ukotvit epiteliální tkáň k sousedním tkáním. Epiteliální buňky také postrádají přímý přístup do krevní cévy, a proto musí získávat kyslík a živiny prostřednictvím difúze, stejným způsobem, že jsou nuceni zbavit se metabolických zplodin. Epitel funguje v různých mechanismech, včetně ochrany, absorpce, smyslového příjmu a sekrece. Epitelové buňky ledvin hrají klíčovou roli při dočasném skladování a následné sekreci vylučovacích materiálů.

kultura Madin-Darbyho psí ledvinové buňky jsou prezentovány v digitální obrázku výše byla označena DAPI a Alexa Fluor 568 konjugovaná na phalloidin, které se zaměřují na DNA v jádru buňky a F-aktinu cytoskeletální sítě, respektive. Kromě toho, buňky byly transfektovaly s pEYFP-Mitochondrie (enhanced yellow fluorescent protein) chimerického plasmidu subcelulární lokalizace vektor. Snímky byly zaznamenány v odstínech šedi s QImaging Retiga Rychle-EXi kamerový systém spojený s Olympus BX-51 mikroskop vybaven pásmovým emisní fluorescenční filtr optické bloky poskytována Omega Optické. Během fáze zpracování byly jednotlivé obrazové kanály pseudokolorovány s hodnotami RGB odpovídajícími každému z emisních spektrálních profilů fluoroforů.

MDCK Epiteliální Buňky s MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, a DAPI – přívrženec kultury Madin-Darbyho psích ledvinových buněk byl označen za intracelulární mitochondriální sítě a pro vláknitý aktin s MitoTracker Red CMXRos a Alexa Fluor 488 konjugovaná na phalloidin, resp. Sonda DAPI absorbující ultrafialové záření byla použita k potlačení DNA.

Cílení Peroxizómech a Clathrin Bílkovin v Madin-Darby Ledvinových Buněk s Imunofluorescence – V této sekci, vybavený kultury MDCK buněk byl immunofluorescently označeny primární anti-clathrin (těžký řetězec) myší monoklonální protilátky následuje kozí anti-myší Fab fragmenty konjugované k kyanová barviva Cy3 s cílem zaměřit se na cytoskeletální sítě. Navíc, peroxizómech přítomny v kultuře byly immunofluorescently označeny Cy2 konjugované kozí sekundární protilátky proti králičí anti-PMP 70 (peroxisomal membránový protein 70) primární protilátky. Jádra byla kontrastována s Hoechst 33342.

Rozšířené Žluté Bílkovin Subcelulární Lokalizace Mitochondrie v MDCK Buňky Kultur – kultura Madin-Darbyho psích ledvinových epiteliálních buněk byl transfektovaly s pEYFP-Mitochondrie (enhanced yellow fluorescent protein) chimerického plasmidu subcelulární lokalizace vektor. Buňky byly také obarví s SYTOX Oranžové a Alexa Fluor 350 konjugovaná na phalloidin, cílení DNA a cytoskeletální vláknitý aktin sítě, respektive.

Imunofluorescence Zaměření Histony a Golgiho Komplex v Psích Ledvinových Epiteliálních Buněčných Kultur – Madin-Darbyho psí ledvinové buňky byly fixovány paraformaldehydem, permeabilized, a přidá se směs z králíka (anti-giantin) a myš (anti-histony; pan) primární protilátky, následované sekundární protilátky konjugované Alexa Fluor 488 a Texas Red, resp. Sekundární protilátka koktejl obsahoval rovněž Alexa Fluor 350 konjugovaná na phalloidin, navržen tak, aby současně cíl vláknitý aktin sítě.

Dvojitá Imunofluorescence Jaderných Pórů Složité Bílkoviny a Tight Junctions v Madin-Darbyho Psí Ledvinové Buňky – Epiteliální buňky, tight junctions a jaderných pórů komplexní proteiny byly současně zobrazen v MDCK buňky s koktejlem mouse anti-NPCP a králičí anti-ZO-3. primární protilátky, následované kozí anti-myší anti-králičí sekundární protilátky konjugované Alexa Fluor 488 a Alexa Fluor 568, resp.

Mitochondriální Sítě v MDCK Buňky – přívrženec jednovrstevné kultury Madin-Darbyho psích ledvinových buněk byl immunofluorescently označené s primární myší anti-oxphos komplexu V inhibitor protein, protilátky, následované kozí anti-myší Fab fragmenty konjugovaný s fluoresceinem. Kultury byly následně obarveny Alexa Fluor 568 konjugovaná na phalloidin odhalit podrobnosti o vláknitý aktin sítě, a DAPI na DNA v jádře.

MDCK Buňky s Wheat Germ Agglutinin – Lektiny jsou specializované třídy, rostlinných bílkovin, které se vážou na specifické sacharidové skupiny připojené proteiny nebo s bydlištěm v buněčných membránách. Prominentní člen této skupiny, aglutinin z pšeničných klíčků se často používá k lokalizaci Golgiho komplexu v experimentech s fluorescenčním značením. Kultura je znázorněno v této části byl označen wheat germ agglutinin konjugované k Texas Red, stejně jako Alexa Fluor 488 konjugovaná na phalloidin a DAPI (cílení DNA v jádře).

Cílení Mitochondrií s Fluorescenčních Proteinů v Psí Ledvinové Buňky Kultur – semi-splývající kultury MDCK buňky byly přechodně transfektovaly s plasmid chiméry obsahující kódující sekvenci pro lepší žlutý fluorescenční protein (EYFP) taveného do mitochondriální cílení sekvence z podjednotky VIII lidský cytochrom C oxidázy. Po fixaci a permeabilization, buňky byly kontrastním pro vláknitý aktin s Alexa Fluor 546 konjugovaná na phalloidin a pro DNA s jadernou specifické barvivo DAPI.

těsné spojení v kulturách Madin-Darby psích ledvin-těsný spojovací protein ZO-3 byl vizualizován imunofluorescencí v konfluentní kultuře MDCK buněk. Králičí anti-ZO-3 protilátky cílení proteinu byly označeny s kozí anti-králičí sekundární Fab fragmenty konjugované k kyanová barviva, Cy3. Jádra byla kontrastována s DNA specifickým fluoroforem DAPI.

MDCK Adherentní Buněčné Kultury s Texas Red, Alexa Fluor 488 a Alexa Fluor 350 – Ve dvoulůžkovém imunofluorescenční značení experiment, kultury MDCK buněk bylo zacházeno s koktejlem myš, anti-histony (pan) a rabbit anti-PMP 70 (peroxisomal membránový protein) primární protilátky. Cílové proteiny byly následně vizualizovány s kozí anti-myší anti-králičí sekundární protilátky konjugované k Texas Red a Alexa Fluor 488, resp. Vláknitá aktinová cytoskeletální síť byla kontrastována s Alexou Fluor 350 konjugovanou s phalloidinem.

Klasické Barvení Vzory v Psích Ledvinových Epitelových Buněk – již tradiční a populární kombinace MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 konjugovaná na phalloidin, a Hoechst 33342 byl použit k triple-label přívrženec kultury MDCK buňky. Všimněte si neobvyklé vláknité aktinové sítě a velkého počtu mitochondrií obklopujících jádra v těchto buňkách.

Subcelulární Lokalizace Mitochondrie s Fluorescenční Proteiny v MDCK Buňky – Po fixaci a permeabilization, kultura MDCK buňky prezentovány v této části byl označen s propidium jodid a Alexa Fluor 350 konjugovaná na phalloidin, které se zaměřují na DNA a vláknitý aktin, resp. Kromě toho, buňky byly nejprve transfektovaly s pEYFP-Mitochondrie plasmidu subcelulární lokalizace vektor, tedy lokalizaci žlutý fluorescenční protein tag intracelulární mitochondriální sítě.

Rozsáhlé Tubulinu Sítě v Madin-Darbyho Psích Ledvinových Epitelových Buněk – Mikrotubuly byly obarveny pomocí imunofluorescence zpracováním pevné a permeabilized kultury MDCK buňky s myší anti-α-tubulin primární protilátky následuje kozí anti-myší protilátky konjugované Alexa Fluor 568. Jádra byla kontrastována SYTOXOVOU zelení. Ačkoli nebyla v této části zobrazena, kultura byla také označena Alexou Fluor 350 konjugovanou na phalloidin.

Simultánní Vizualizaci Clathrin, Peroxizómech a Jádra v MDCK Buňky Kultur – kultura MDCK buňky prezentovány v této části byl immunofluorescently označeny primární anti-clathrin (těžký řetězec) myší monoklonální protilátky následuje kozí anti-myší Fab fragmenty konjugované k kyanová barviva Cy3 s cílem zaměřit se na cytoskeletální sítě. Kromě toho, peroxizómech přítomny v kultuře byly immunofluorescently označeny Cy2 konjugované kozí sekundární protilátky proti králičí anti-PMP 70 (peroxisomal membránový protein 70) primární protilátky. Jádra byla kontrastována s Hoechst 33342.

síť mezilehlých vláken Cytokeratinu v epiteliálních buňkách psích ledvin-Cytokeratin je běžnou a hojnou složkou sítě mezilehlých vláken v epiteliálních buňkách. Na adherentní kultura v této části byl immunofluorescently označeny myší anti-cytokeratin (pan) primární protilátky, následované kozí anti-myší sekundární protilátky konjugované Marina Modrá. Mitochondrie byly vizualizovány MitoTracker Red CMXRos a jádra byla obarvena SYTOX zeleně.

Madin-Darbyho Psí Ledvinové Buňky s Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, a Hoechst 33258 – Simultánní lokalizace tight junctions a jaderných pórů složité bílkoviny (NPCP) byla provedena s manželskou imunofluorescence experimentovat s MDCK buněk pomocí myší anti-NPCP a králičí anti-ZO-3. primární protilátky. Subcelulární cíle byly vizualizovány pomocí kozí anti-myší anti-králičí sekundární protilátky (IgG) konjugovaný s Alexa Fluor 488 a Alexa Fluor 568, resp. DNA v jádrech byla kontrastována pomocí Hoechst 33258.

Immunofluorescent Označení Mitochondriální Sítě v MDCK Buňky Kultur – Madin-Darbyho psí ledvinové buňky byly immunofluorescently označené s primární myší anti-oxphos komplexu V inhibitor protein, protilátky, následované kozí anti-myší Fab fragmenty konjugovaný s fluoresceinem. Kultury byly následně obarveny Alexa Fluor 568 konjugovaná na phalloidin odhalit podrobnosti o vláknitý aktin sítě, a DAPI na DNA v jádře.

MitoTracker Red CMXRos, Cy2, a Hoechst 33258 v Madin-Darbyho Psích Ledvinových Buněk – pevné a permeabilized adherentní kultury Madin-Darbyho psích ledvinových buněk byl immunofluorescently označené s primární myší anti-cytokeratin protilátky, následované kozí anti-myší Fab fragmenty konjugované k kyanová barviva, Cy2. Před fixací byla kultura ošetřena po dobu jedné hodiny MitoTracker Red CMXRos a po ošetření protilátkami byla jádra kontrastována Hoechst 33258.

Vazba Lektinů do Golgiho Komplexu v MDCK Epiteliální Buněčné Kultury – pro vizualizaci lektin vazba na Golgiho komplex v MDCK buňky, přívrženec kultury bylo zacházeno s pšeničných klíčků aglutinin konjugovaná na Oregon Green. Buňky byly následně kontrastním s Alexa Fluor 568 konjugovaná na phalloidin lokalizovat vláknitý aktin sítě, a nukleové kyseliny skvrna DAPI na štítku DNA v jádře.

Přilnavý MDCK Buňky s Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, a Hoechst 33342 – Alexa Fluor barviv byly použity k vizualizaci rozložení clathrin a peroxisomal membránový protein 70 (PMP 70) v kultuře Madin-Darby canine kidney epiteliální buňky. Po imunofluorescenční reakce, buňky byly kontrastním s Hoechst 33342 odhalit umístění jader.

Madin-Darbyho Psí Ledvinové Buňky s MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, a DAPI – Jeden z nejvíce užitečných fluorophore kombinace pro vizualizaci vnitřní buněčné detaily zahrnuje MitoTracker Red CMXRos, aby cíl mitochondrie, Alexa Fluor 488 konjugovaná na phalloidin pro vláknitý aktin sítě, a DAPI lokalizovat jádra.

Vizualizace Mikrotubulové a Aktin Cytoskeletální Sítí v MDCK Buňky Kultury – aby se současně vizualizovat jak aktinu a tubulinu sítí v MDCK buňky, pevné a permeabilized kultury bylo zacházeno s myší anti-α-tubulin primární protilátky, následuje koktejl kozí anti-myší sekundární protilátky konjugované Alexa Fluor 568 smíchány s Alexa Fluor 350 konjugovaná na phalloidin. Jádra byla kontrastována SYTOXOVOU zelení.

Dvojitá Imunofluorescence Jaderných Pórů Složité Bílkoviny a Tight Junctions v Madin-Darbyho Psí Ledvinové Buňky – Epiteliální buňky, tight junctions a jaderných pórů komplexní proteiny byly současně zobrazen v MDCK buňky s koktejlem mouse anti-NPCP a králičí anti-ZO-3. primární protilátky, následované kozí anti-myší anti-králičí sekundární protilátky konjugované Alexa Fluor 568 a Alexa Fluor 488, resp. Jádra byla kontrastována s Hoechst 33258.

Blízkosti Jádra a Golgiho Komplexu v Monovrstva MDCK Buňky Kultur – blízko takových památek, mezi Golgiho komplex a jádra v Madin-Darbyho psích ledvinových buněk byl sondoval ve dvoulůžkovém imunofluorescence experiment s myší anti-NPCP (nuclear pore complex protein) a rabbit anti-giantin (Golgiho komplex) primární protilátky. Protilátky cíle byly vizualizovány s kozí sekundární protilátky konjugované Alexa Fluor 568 a Alexa Fluor 488, respektive, zatímco aktin cytoskeletální rámec byl označen s Alexa Fluor 350 konjugovaná na phalloidin.