Moleculaire expressies microscopie Primer: gespecialiseerde microscopie technieken-fluorescentie Digital Image Gallery-Madin-Darby Canine nier epitheliale cellen (MDCK)

afgeleid door S. H. Madin en N. B. Darby uit het nierweefsel van een volwassen vrouwelijke cocker spaniel, de mdck cellijn ontstond in september 1958. Sinds die tijd, zijn de cellen wijd gebruikt om de verwerking van BÃ ta-amyloid precursor proteã ne, evenals het sorteren van zijn proteolytic producten te onderzoeken.

de morfologie van de mdck-cellijn is epitheliaal, en de cellen zijn positief voor keratine door immunoperoxidase het bevlekken. Virussen die gevoelig zijn voor mdck-cellen omvatten vesiculaire stomatitis( Indiana stam), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 en 3, adenovirus 4 en 5, vesiculair exantheem van varkens en infectieuze honden hepatitis. De cellen vertonen weerstand tegen coxsackievirus B3 en B4 evenals poliovirus 2, en zijn negatief voor omgekeerde transcriptase.

de mdck-lijn wordt algemeen gebruikt als een algemeen model voor epitheelcellen, die het type weefsel bevatten dat bekend staat als epithelium. Voornamelijk gevonden die betrekking hebben op de interne organen en andere oppervlakken van het lichaam, epitheel bestaat uit strak verpakte cellen die zijn georganiseerd in vellen. Deze cellen scheiden een extracellulaire matrijs genoemd de basale lamina bij hun basis af, die helpt het epitheliaale weefsel aan aangrenzende weefsels te verankeren. Epitheliale cellen hebben ook geen directe toegang tot bloedvaten en moeten daarom zuurstof en voedingsstoffen verkrijgen door diffusie, op dezelfde manier als ze worden gedwongen zich te ontdoen van metabolische afvalproducten. Epithelia functie in een verscheidenheid van mechanismen, met inbegrip van bescherming, absorptie, sensorische ontvangst, en secretie. De epitheliale cellen van de nieren spelen een belangrijke rol in de tijdelijke opslag en daaropvolgende secretie van uitscheidingsmaterialen.

de cultuur van Madin-Darby canine niercellen zoals weergegeven in de digitale afbeelding hierboven werd gelabeld met DAPI en Alexa Fluor 568 geconjugeerd aan phalloidine, die respectievelijk gericht zijn op DNA in de celkern en het F-actin cytoskeletal network. Bovendien werden de cellen getransfecteerd met een pEYFP-Mitochondria (verbeterde gele fluorescente proteã ne) chimerische plasmide subcellulaire localisatievector. Beelden werden opgenomen in grijswaarden met een Qimaging Retiga Fast-EXi Camerasysteem gekoppeld aan een Olympus BX-51 microscoop uitgerust met bandpass emissie fluorescentie filter optische blokken geleverd door Omega Optical. Tijdens het verwerkingsstadium, werden de individuele beeldkanalen pseudocolored met RGB-waarden die aan elk van de spectrale profielen van de fluorophore emissie corresponderen.

MDCK Epitheliale Cellen met MitoTracker Rode CMXRos, Alexa Fluor 488, en DAPI – Een aanhanger cultuur van Madin-Darby canine nieren cellen gelabeld was voor de intracellulaire mitochondriale netwerk en voor filamenteuze actin met MitoTracker Rode CMXRos en Alexa Fluor 488 toegevoegd aan phalloidin, respectievelijk. De ultraviolet-absorberende sonde DAPI werd gebruikt om DNA tegen te gaan.

Targeting peroxisomen en Clathrineiwitten in Madin-Darby niercellen met immunofluorescentie – in deze rubriek werd de kenmerkende cultuur van mdck-cellen immunofluorescentie gelabeld met primaire monoklonale antilichamen tegen clathrin (zware keten) muizen gevolgd door Fab-fragmenten van geiten anti-muizen geconjugeerd aan de cyanine kleurstof Cy3 om het cytoskeletale netwerk te bereiken. Bovendien werden de in de cultuur aanwezige peroxisomen immunofluorescent gelabeld met Cy2 geconjugeerd aan secundaire geitenantilichamen gericht tegen primaire anti-PMP 70 (peroxisomaal membraaneiwit 70) antilichamen van konijnen. Met Hoechst 33342 werden de kernen tegengewerkt.

verbeterde subcellulaire lokalisatie van het gele eiwit van mitochondriën in Mdck – celculturen-een cultuur van Madin-Darby canine nierepitheliale cellen werd getransfecteerd met een pEYFP-mitochondriën (enhanced yellow fluorescent protein) chimerische subcellulaire lokalisatievector van het plasmide. De cellen werden ook bevlekt met SYTOX Orange en Alexa Fluor 350 vervoegd aan phalloidin, richtend DNA en het cytoskeletal filamentous actin netwerk, respectievelijk.

immunofluorescentie Targeting van de histonen en Golgi Complex in Canine nier epitheliale celculturen-Madin-Darby canine niercellen werden gefixeerd met paraformaldehyde, permeabiliseerd en behandeld met een mengsel van primaire antilichamen van konijnen (anti-giantine) en muizen (anti-histonen; pan), gevolgd door secundaire antilichamen geconjugeerd aan respectievelijk Alexa Fluor 488 en Texas Red. De secundaire antilichaamcocktail bevatte ook Alexa Fluor 350 die aan phalloidin wordt vervoegd, die wordt ontworpen om gelijktijdig het filamentous actin netwerk te richten.

Dubbele immunofluorescentie van Nuclear Pore Complex proteïnen en Tight Junctions in Madin-Darby Canine niercellen – epitheliale cel tight junctions en nuclear pore complex proteïnen werden gelijktijdig afgebeeld in MDCK cellen met een cocktail van muizen anti-NPCP en konijnen anti-ZO-3 primaire antilichamen, gevolgd door geiten anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen geconjugeerd aan respectievelijk Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 568.

het mitochondriale netwerk in MDCK-cellen – een adherente monolaagcultuur van Madin-Darby canine niercellen werd immunofluorescent gelabeld met primaire muizen anti-oxfos complex V inhibitor proteïne antilichamen, gevolgd door geiten anti-muis Fab fragmenten geconjugeerd aan fluoresceïne. De cultuur werd later bevlekt met Alexa Fluor 568 vervoegd aan phalloidin om details van het filamentous actin netwerk, en DAPI voor DNA in de kern te onthullen.

Mdck-cellen met Tarwekiemagglutinine-lectinen zijn een gespecialiseerde klasse plantaardige eiwitten die zich binden aan specifieke koolhydraatgroepen die aan eiwitten gebonden zijn of in celmembranen verblijven. Een prominent lid van deze groep, wordt tarwekiem agglutinine vaak gebruikt om het Golgi-complex in fluorescentieetiketteringsexperimenten te lokaliseren. De cultuur die in deze sectie wordt geà llustreerd werd geëtiketteerd met tarwekiem agglutinine vervoegd aan Texas rood, evenals Alexa Fluor 488 vervoegd aan phalloidin en DAPI (het richten van DNA in de kern).

Targeting mitochondriën met fluorescente eiwitten in Canine Niercelculturen-een semi-samenvloeiende cultuur van MDCK-cellen werd tijdelijk getransfecteerd met een plasmide chimera die de codering voor enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) bevat, gefuseerd met de mitochondriale targeting sequentie van subeenheid VIII van humaan cytochroom c-oxidase. Na fixatie en permeabilization, werden de cellen voor filamentous actin met Alexa Fluor 546 geconjugeerd aan phalloidin en voor DNA met de nucleair-specifieke kleurstof, DAPI tegengegaan.

Tight Junctions in Madin-Darby Canine Niercelculturen-het tight junction eiwit ZO-3 werd gevisualiseerd door immunofluorescentie in een samenvloeiende cultuur van MDCK-cellen. Anti-zo-3-antilichamen van konijnen gericht op het eiwit werden gelabeld met secundaire Fab-fragmenten van geit-anti konijn geconjugeerd aan de cyaninekleurstof Cy3. De kernen werden met DNA-specifieke fluorophore DAPI tegengegaan.

Mdck-adherente celculturen met Texas Red, Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 350 – in een dubbel immunofluorescentieetiketteringsexperiment werd een cultuur van mdck-cellen behandeld met een cocktail van muizen anti-histonen (pan) en konijnen anti-PMP 70 (peroxisomaal membraaneiwit) primaire antilichamen. De doelproteã nen werden later gevisualiseerd met geit anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen vervoegd aan Texas Red en Alexa Fluor 488, respectievelijk. Het filamenteuze actin cytoskeletal netwerk werd met Alexa Fluor 350 geconjugeerd aan phalloidin tegengegaan.

klassieke Kleuringspatronen in epitheelcellen van Hondennieren – de nu traditionele en populaire combinatie van MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 geconjugeerd aan phalloidine en Hoechst 33342 werd gebruikt om een adherente cultuur van MDCK-cellen te Triple-labelen. Let op het ongebruikelijke filamenteuze actin netwerk, en het grote aantal mitochondria die de kernen in deze cellen omringen.

subcellulaire lokalisatie van mitochondriën met fluorescerende eiwitten in Mdck – cellen-na fixatie en permeabilisatie werd de cultuur van mdck-cellen in deze sectie gelabeld met propidium jodide en Alexa Fluor 350 geconjugeerd aan phalloidine, die respectievelijk gericht zijn op DNA en filamenteus actine. Bovendien, werden de cellen eerst getransfecteerd met een peyfp-Mitochondria plasmide subcellular localisatievector, waarbij een gele fluorescente eiwitmarkering aan het intracellular mitochondrial netwerk wordt gelokaliseerd.

het uitgebreide Tubulinenetwerk in Madin-Darby Canine Nierepitheliale cellen-microtubuli werden gekleurd met behulp van immunofluorescentie door het behandelen van een vaste en permeabiliseerde cultuur van MDCK-cellen met muizen-anti-Alfa-tubuline primaire antilichamen gevolgd door geiten-anti-muizen antilichamen geconjugeerd aan Alexa Fluor 568. De kernen werden tegengewerkt met SYTOX Green. Hoewel niet afgebeeld in deze sectie, werd de cultuur ook gelabeld met Alexa Fluor 350 geconjugeerd aan phalloidin.

gelijktijdige visualisatie van Clathrine, peroxisomen en kernen in Mdck – celculturen-de cultuur van MDCK-cellen die in deze sectie wordt gepresenteerd, werd immunofluorescerend geëtiketteerd met primaire monoklonale antilichamen tegen clathrin (zware keten) muizen, gevolgd door Fab-fragmenten van geiten anti-muizen, geconjugeerd aan de cyaankleurstof Cy3 om het cytoskeletale netwerk te bereiken. Bovendien werden de in de cultuur aanwezige peroxisomen immunofluorescentie gelabeld met Cy2 geconjugeerd aan secundaire geitenantilichamen gericht tegen primaire anti-PMP 70 (peroxisomaal membraaneiwit 70) antilichamen van konijnen. Met Hoechst 33342 werden de kernen tegengewerkt.

het intermediaire Filamentnetwerk van Cytokeratine in epitheliale cellen van Hondennieren – Cytokeratine is een veel voorkomende en overvloedige component van het intermediaire filamentnetwerk in epitheliale cellen. De aanhangende cultuur in deze sectie was immunofluorescerend gelabeld met muizen anti-cytokeratine (pan) primaire antilichamen, gevolgd door geiten anti-muis secundaire antilichamen geconjugeerd aan Marina Blue. Mitochondriën werden gevisualiseerd met MitoTracker rode CMXRos en de kernen werden gekleurd met SYTOX groen.

Madin-Darby Canine niercellen met Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 en Hoechst 33258-gelijktijdige lokalisatie van tight junctions en de nuclear pore complex proteins (NPCP) werd uitgevoerd met een dubbel immunofluorescentie-experiment met MDCK-cellen met muizen anti-NPCP en konijnen anti-zo-3 primaire antilichamen. De subcellulaire doelen werden gevisualiseerd met geit anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen (IgG) geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 568, respectievelijk. Het DNA in de kernen werd met Hoechst 33258 tegengegaan.

Immunofluorescente etikettering van het mitochondriale netwerk in Mdck-celculturen-Madin-Darby canine niercellen werden immunofluorescerend gelabeld met primaire anti-oxfos complex V inhibitor eiwitantilichamen, gevolgd door geiten anti-muis Fab-fragmenten geconjugeerd aan fluoresceïne. De cultuur werd later bevlekt met Alexa Fluor 568 vervoegd aan phalloidin om details van het filamentous actin netwerk, en DAPI voor DNA in de kern te onthullen.

MitoTracker Red CMXRos, Cy2, en Hoechst 33258 in Madin-Darby Canine niercellen-een gefixeerde en permeabiliseerde adherente cultuur van Madin-Darby canine niercellen werd immunofluorescent gelabeld met primaire muizen anti-cytokeratine antilichamen, gevolgd door geiten anti-muis Fab fragmenten geconjugeerd aan de cyanine kleurstof, Cy2. Vóór de fixatie werd de kweek gedurende een uur behandeld met MitoTracker Red CMXRos, en na de antilichaambehandelingen werden de kernen tegengegaan met Hoechst 33258.

Binding van lectinen aan het Golgi – Complex in epitheliale celculturen van MDCK-om de binding van lectine aan het Golgi-complex in MDCK-cellen te visualiseren, werd een aanhangende cultuur behandeld met tarwekiemen agglutinine geconjugeerd aan Oregon Green. De cellen werden later counterstained met Alexa Fluor 568 vervoegd aan phalloidin om het filamentous actin netwerk te lokaliseren, en de nucleic zure vlek DAPI om DNA in de kern te etiketteren.

adherente Mdck-cellen met Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 en Hoechst 33342 – Alexa Fluor kleurstoffen werden gebruikt om de distributie van clathrine en het peroxisomale membraaneiwit 70 (PMP 70) in een cultuur van Madin-Darby canine nier epitheliale cellen te visualiseren. Na de immunofluorescentiereacties werden de cellen met Hoechst 33342 tegengewerkt om de locatie van de kernen te onthullen.

Madin-Darby Canine niercellen met MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 en DAPI-een van de meest bruikbare fluorofore combinaties voor het visualiseren van interne cellulaire details omvat MitoTracker Red CMXRos om mitochondriën te richten, Alexa Fluor 488 geconjugeerd aan phalloidine voor het filamenteuze actin netwerk, en DAPI om de kernen te lokaliseren.

het Visualiseren van de Microtubule en Actine Cytoskelet Netwerken in MDCK Cel Culturen – om tegelijkertijd het visualiseren van zowel de actine en tubuline netwerken in MDCK cellen, een vaste en permeabilized cultuur werd behandeld met de muis anti-α-tubuline primaire antilichamen, gevolgd door een cocktail van geit anti-muis secundaire antilichamen conjugated Alexa Fluor 568 gemengd met Alexa Fluor 350 toegevoegd aan phalloidin. De kernen werden tegengewerkt met SYTOX Green.

Dubbele immunofluorescentie van Nuclear Pore Complex proteïnen en Tight Junctions in Madin-Darby Canine niercellen – epitheliale cel tight junctions en nuclear pore complex proteïnen werden gelijktijdig afgebeeld in MDCK cellen met een cocktail van muizen anti-NPCP en konijnen anti-ZO-3 primaire antilichamen, gevolgd door geiten anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen geconjugeerd aan respectievelijk Alexa Fluor 568 en Alexa Fluor 488. Met Hoechst 33258 werden de kernen tegengewerkt.

nabijheid van de kern en het Golgi – Complex in monolaag Mdck-celculturen-de nabijheid tussen het Golgi-complex en de kernen in Madin-Darby canine niercellen werd onderzocht in een dubbel immunofluorescentie-experiment met muizen anti-NPCP (nuclear pore complex protein) en konijnen anti-giantine (Golgi complex) primaire antilichamen. De antilichaamdoelen werden gevisualiseerd met geit secundaire antilichamen vervoegd aan Alexa Fluor 568 en Alexa Fluor 488, respectievelijk, terwijl het actin cytoskeletal kader met Alexa Fluor 350 werd geëtiketteerd aan phalloidin.