Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je jedním z nejvíce používaných metod pro separaci a purifikaci proteinů v nativním stavu. HIC se také ukazuje jako docela užitečný při izolaci proteinových komplexů a při studiu skládání a rozvíjení bílkovin. Jak tedy HIC funguje? Jaké jsou principy této techniky? Abychom pochopili mechanismus tohoto typu chromatografie, zde je několik věcí, které určitě potřebujete vědět.
jak HIC působí?
Stručně řečeno, HIC (také známý jako „solení“) odděluje proteinové molekuly pomocí vlastností hydrofobicity. Při této metodě se proteiny obsahující hydrofilní i hydrofobní oblasti aplikují na kolonu HIC za podmínek vysokého solného pufru.
solí v pufru (obvykle síran amonný), snižuje solvatační vzorku rozpuštěných látek a vystavuje hydrofobní regiony podél povrchu molekuly proteinu. To usnadňuje adsorpci těchto hydrofobních oblastí do hydrofobních oblastí na pevném nosiči a vysráží (krystalizuje) proteiny z roztoku.
Mějte na paměti, že při provádění tohoto typu chromatografie, přidání lyotrophic soli zvyšuje hydrofobní účinek a snižuje počet a objem jednotlivých hydrofobních dutin při snížení koncentrace soli bude mít za následek desorpci od solidní podporu. Jako takový, eluce vzorku může být usnadněna snížením gradientu soli. Mírné organické modifikátory nebo čisticí prostředky mohou být také přidány do elučního pufru na podporu v eluční proces.
Pomocí zásad HIC, můžete vázat proteiny z vodných roztoků v různé míře v závislosti na struktuře bílkoviny, zájmů, koncentrace soli, pH, teplota a organických rozpouštědel používaných.
Hydrofobní Interakční Chromatografie: Odhalení Hlubších Teorií
Existují tři hlavní teorie, které mohou pomoci vysvětlit mechanismus za HIC – (1) solení teorie, (2) termodynamické teorie a (3) povrchové napětí nebo Van der Waalsovy síly teorie.
Solení Teorie
Podle solení teorie, hydrofobní aminokyseliny tvoří chráněné hydrofobních oblastí na skládání ve vodném roztoku, zatímco hydrofilní aminokyseliny umožňují proteiny pro vazbu s molekulami vodíku ve vodě. Jako výsledek, pravděpodobnost, že protein se rozpustí ve vodě se zvýší, pokud dostatečně hydrofilní oblasti, jsou přítomny na povrchu molekul proteinů.
Nicméně, po přidání anti-chaotrophic soli (např. síranu amonného a síranu sodného) v roztoku, některé molekuly vody bude komunikovat s ionty soli místo nabité části proteinu. Když je protein-protein interakcí v roztoku silnější než rozpouštědlo-rozpuštěná látka interakce molekul proteinu reagovat svobodně s druhými – což jim umožní agregovat a nakonec srážet ven z roztoku. Proto přidání soli do roztoku snižuje rozpustnost různých proteinů v různé míře.
Termodynamiky, Teorie
Tato teorie říká, že interakce mezi hydrofobní molekuly je entropie-řízený proces, na základě druhého zákona Termodynamiky. Hydrofobní interakce mezi dvěma nebo více nepolárními molekulami v polárním roztoku rozpouštědla je spontánní proces řízený změnou entropie. Takové interakce však mohou být změněny regulací teploty nebo úpravou polarity rozpouštědla.
jako takový, když nepolární molekula přijde do styku s polárním rozpouštědlem, jako je voda, dojde ke zvýšení stupně pořadí molekul rozpouštědla obklopujících hydrofobní molekulu. Dokud se entalpie významně nezvýší, způsobí to pokles entropie a poskytne celkově pozitivní změnu Gibbsovy energie. Rozpouštění nepolární molekuly v polárním rozpouštědle se tedy nevyskytuje spontánně, protože není termodynamicky příznivé.
Nicméně, když dáte dva nebo více non-polární molekuly v polárním prostředí, hydrofobní povrchy makromolekul bude skrytý od okolní polární a hydrofobní molekuly agregovat spontánně. Vysoce strukturované molekuly rozpouštědla obklopující exponovaný povrch hydrofobních molekul budou přemístěny směrem k objemu rozpouštědla sestávajícího z méně strukturovaných molekul. V důsledku toho se entropie zvyšuje, zatímco Gibbsova energie klesá. V takových případech se hydrofobní interakce stává termodynamicky příznivým procesem.
Povrchové Napětí, Van der Waalsovy Teorie
Tato teorie naznačuje, že hydrofobní interakce v HIC je závislá na van der Waalsovy síly mezi proteiny a imobilizovaných ligandů, protože tyto síly se zvyšují jako uspořádaná struktura vody se zvyšuje v přítomnosti solení se solí.