Interazione idrofobica cromatografia (HIC) è uno dei metodi più utilizzati per separare e purificare le proteine nel loro stato nativo. HIC si rivela anche molto utile nell’isolare i complessi proteici e nello studio del ripiegamento e dello sviluppo delle proteine. Quindi, come funziona HIC? Quali sono i principi alla base di questa tecnica? Per capire il meccanismo alla base di questo tipo di cromatografia, qui ci sono alcune cose che sicuramente bisogno di sapere.
Come agisce l’HIC?
In poche parole, l’HIC (noto anche come “salatura”) separa le molecole proteiche usando le proprietà dell’idrofobicità. In questo metodo, le proteine contenenti sia regioni idrofile che idrofobiche vengono applicate a una colonna HIC in condizioni di tampone salino elevato.
Il sale nel tampone (solitamente solfato di ammonio) riduce la solvatazione dei soluti del campione ed espone le regioni idrofobiche lungo la superficie della molecola proteica. Ciò facilita l’adsorbimento di queste regioni idrofobe alle aree idrofobiche sul supporto solido e precipita (cristallizza) le proteine dalla soluzione.
Tenere presente che durante l’esecuzione di questo tipo di cromatografia, l’aggiunta di sali liotrofi aumenta l’effetto idrofobo e riduce il numero e il volume delle singole cavità idrofobiche mentre diminuendo la concentrazione di sale si tradurrà in desorbimento dal supporto solido. Come tale, l’eluizione del campione può essere facilitata diminuendo il gradiente di sale. Modificatori organici delicati o detergenti possono anche essere aggiunti al tampone di eluizione per aiutare nel processo di eluizione.
Utilizzando i principi di HIC, è possibile legare le proteine da soluzioni acquose in vari gradi a seconda della struttura della proteina di interesse, concentrazione di sale, pH, temperatura e solventi organici utilizzati.
Cromatografia a interazione idrofobica: Scoprire le teorie sottostanti
Ci sono tre teorie principali che possono aiutare a spiegare il meccanismo alla base di HIC – (1) la teoria della salatura, (2) la teoria termodinamica e (3) la tensione superficiale o teoria delle forze di Van der Waals.
Teoria della salatura
Secondo la teoria della salatura, gli amminoacidi idrofobi formano aree idrofobiche protette dopo la piegatura in soluzione acquosa mentre gli amminoacidi idrofili consentono alle proteine di legarsi con le molecole di idrogeno nell’acqua. Di conseguenza, la probabilità che la proteina si dissolva in acqua aumenterà se sono presenti abbastanza aree idrofile nella superficie delle molecole proteiche.
Tuttavia, dopo l’aggiunta di sali anti-chaotrophic (come solfato di ammonio e solfato di sodio) nella soluzione, alcune delle molecole d’acqua interagiranno con gli ioni sale invece della parte carica della proteina. Quando le interazioni proteina-proteina nella soluzione diventano più forti delle interazioni solvente-soluto, le molecole proteiche reagiscono liberamente l’una con l’altra, consentendo loro di aggregarsi e alla fine precipitare fuori dalla soluzione. Quindi, l’aggiunta di sale nella soluzione riduce la solubilità di diverse proteine in misura variabile.
Teoria della termodinamica
Questa teoria afferma che l’interazione tra molecole idrofobiche è un processo guidato dall’entropia, basato sulla seconda legge della termodinamica. L’interazione idrofobica tra due o più molecole non polari in una soluzione di solvente polare è un processo spontaneo governato da un cambiamento di entropia. Tuttavia, tali interazioni possono essere alterate controllando la temperatura o modificando la polarità del solvente.
Come tale, quando una molecola non polare entra in contatto con un solvente polare come l’acqua, ci sarà un aumento del grado di ordine delle molecole di solvente che circondano la molecola idrofoba. Finché l’entalpia non aumenta in modo significativo, ciò produrrà una diminuzione dell’entropia e fornirà un cambiamento complessivo positivo nell’energia di Gibbs. Come tale, la dissoluzione di una molecola non polare in un solvente polare non avverrà spontaneamente poiché non è termodinamicamente favorevole.
Tuttavia, quando si mettono due o più molecole non polari in un ambiente polare, le superfici idrofobiche delle macromolecole saranno nascoste dall’ambiente polare circostante e le molecole idrofobiche si aggregheranno spontaneamente. Le molecole di solvente altamente strutturate che circondano la superficie esposta delle molecole idrofobiche saranno spostate verso la maggior parte del solvente costituito da molecole meno strutturate. Di conseguenza, l’entropia aumenta mentre l’energia di Gibbs diminuisce. In questi casi, l’interazione idrofobica diventa un processo termodinamicamente favorevole.
Tensione superficiale, Teoria di Van der Waals
Questa teoria suggerisce che l’interazione idrofobica in HIC dipende dalle forze di van der Waals tra proteine e ligandi immobilizzati poiché queste forze aumentano all’aumentare della struttura ordinata dell’acqua in presenza di sali salanti.