hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia (HIC) on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä proteiinien erottamiseksi ja puhdistamiseksi niiden kotimaassa. HIC osoittautuu myös varsin hyödylliseksi eristettäessä proteiinikomplekseja ja tutkittaessa proteiinin taittumista ja avautumista. Miten HIC vaikuttaa? Mitkä ovat tämän tekniikan periaatteet? Jotta ymmärtäisit mekanismin tämän tyyppisen kromatografian takana, tässä on muutamia asioita, jotka sinun on ehdottomasti tiedettävä.
miten HIC vaikuttaa?
pähkinänkuoressa HIC (tunnetaan myös nimellä ”suolaus pois”) erottaa proteiinimolekyylit hydrofobisuuden ominaisuuksien avulla. Tässä menetelmässä HIC-kolonniin levitetään proteiineja, jotka sisältävät sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia alueita korkeissa suolapuskuriolosuhteissa.
puskurissa oleva suola (yleensä ammoniumsulfaatti) vähentää näyteliuosten solvausta ja altistaa proteiinimolekyylin pinnalla olevat hydrofobiset alueet. Tämä helpottaa näiden hydrofobisten alueiden adsorptiota kiinteän tuen hydrofobisiin alueisiin ja saostuu (kiteytyy) proteiineja liuoksesta.
on muistettava, että tämän tyyppisessä kromatografiassa lyotrofisten suolojen lisääminen tehostaa hydrofobista vaikutusta ja vähentää yksittäisten hydrofobisten onteloiden määrää ja tilavuutta samalla kun suolapitoisuus vähenee, johtaa desorptioon kiinteästä kannasta. Sellaisenaan näytteen eluutiota voidaan helpottaa vähentämällä suolagradienttia. Eluutiopuskuriin voidaan lisätä myös mietoja luomumuunnoksia tai pesuaineita eluutioprosessin helpottamiseksi.
HIC: n periaatteiden mukaisesti voit sitoa valkuaisaineita vesiliuoksista vaihtelevassa määrin riippuen valkuaisaineen rakenteesta, suolapitoisuudesta, pH: sta, lämpötilasta ja käytetyistä orgaanisista liuottimista.
Hydrofobinen Vuorovaikutuskromatografia: Taustalla olevien teorioiden
paljastamisessa on kolme suurta teoriaa, jotka voivat auttaa selittämään hic: n mekanismin – (1) suolausteorian, (2) termodynaamisen teorian ja (3) pintajännitys-eli Van der Waalsin voimateorian.
Suolausteoria
suolausteoria
suolausteorian mukaan hydrofobiset aminohapot muodostavat suojattuja hydrofobisia alueita kokoontuessaan vesiliuokseen, kun taas hydrofiiliset aminohapot antavat proteiinien sitoutua vedessä oleviin vetymolekyyleihin. Tämän seurauksena proteiinin liukenemisen todennäköisyys veteen kasvaa, jos proteiinimolekyylien pinnalla on riittävästi hydrofiilisiä alueita.
kuitenkin, kun liuokseen lisätään antikaotrofisia suoloja (kuten ammoniumsulfaattia ja natriumsulfaattia), osa vesimolekyyleistä vuorovaikuttaa suola-ionien kanssa proteiinin varautuneen osan sijaan. Kun proteiinin ja proteiinin välinen vuorovaikutus liuoksessa muuttuu voimakkaammaksi kuin liuotin-liuotin-vuorovaikutus, proteiinimolekyylit reagoivat vapaasti keskenään, jolloin ne kerääntyvät ja lopulta saostuvat liuoksesta. Suolan lisääminen liuokseen siis vähentää eri proteiinien liukoisuutta vaihtelevasti.
Termodynamiikkateoria
tämän teorian mukaan hydrofobisten molekyylien välinen vuorovaikutus on entropiaan perustuva prosessi, joka perustuu termodynamiikan toiseen lakiin. Kahden tai useamman ei-polaarisen molekyylin hydrofobinen vuorovaikutus polaarisessa liuotinliuoksessa on spontaani prosessi, jota säätelee entropian muutos. Tällaisia yhteisvaikutuksia voidaan kuitenkin muuttaa säätelemällä lämpötilaa tai muuttamalla liuottimen polaarisuutta.
sellaisenaan, kun ei-polaarinen molekyyli joutuu kosketuksiin polaarisen liuottimen kuten veden kanssa, hydrofobista molekyyliä ympäröivien liuotinmolekyylien järjestysaste kasvaa. Niin kauan kuin entalpia ei kasva merkittävästi, tämä aiheuttaa entropian vähenemisen ja tarjoaa kaiken kaikkiaan positiivisen muutoksen Gibbsin energiassa. Sellaisenaan ei-polaarisen molekyylin liukeneminen polaariseen liuottimeen ei tapahdu spontaanisti, koska se ei ole termodynaamisesti suotuisa.
kuitenkin, kun kaksi tai useampia ei-polaarisia molekyylejä laitetaan polaariseen ympäristöön, makromolekyylien hydrofobiset pinnat jäävät piiloon polaarisesta ympäristöstä ja hydrofobiset molekyylit kasautuvat spontaanisti. Hydrofobisten molekyylien paljasta pintaa ympäröivät erittäin rakenteelliset liuotinmolekyylit siirtyvät kohti liuottimen suurinta osaa, joka koostuu vähemmän rakenteellisista molekyyleistä. Tämän seurauksena entropia kasvaa samalla kun Gibbsin energia pienenee. Tällaisissa tapauksissa hydrofobisesta vuorovaikutuksesta tulee termodynaamisesti suotuisa prosessi.
pintajännitys, Van der Waalsin teoria
tämän teorian mukaan hydrofobinen vuorovaikutus HIC: ssä riippuu van der Waalsin proteiinien ja immobilisoituneiden ligandien välisistä voimista, koska nämä voimat kasvavat veden järjestyneen rakenteen kasvaessa suolojen suolaantuessa.