cromatografia de interacțiune hidrofobă (hic) este una dintre cele mai utilizate metode de separare și purificare a proteinelor în starea lor nativă. HIC se dovedește, de asemenea, destul de util în izolarea complexelor proteice și în studierea plierii și desfășurării proteinelor. Deci, cum funcționează HIC? Care sunt principiile din spatele acestei tehnici? Pentru a înțelege mecanismul din spatele acestui tip de cromatografie, iată câteva lucruri pe care cu siguranță trebuie să le cunoașteți.
cum funcționează IAP?
pe scurt, HIC (cunoscut și sub numele de sărare) separă moleculele de proteine folosind proprietățile hidrofobicității. În această metodă, proteinele care conțin atât regiuni hidrofile, cât și hidrofobe sunt aplicate pe o coloană HIC în condiții tampon de sare ridicat.
sarea din tampon (de obicei sulfat de amoniu) reduce solvatarea substanțelor dizolvate de probă și expune regiunile hidrofobe de-a lungul suprafeței moleculei de proteină. Acest lucru facilitează adsorbția acestor regiuni hidrofobe în zonele hidrofobe de pe suportul solid și precipită (cristalizează) proteinele din soluție.
rețineți că atunci când efectuați acest tip de cromatografie, adăugarea de săruri liotrofice îmbunătățește efectul hidrofob și reduce numărul și volumul cavităților hidrofobe individuale, în timp ce scăderea concentrației de sare va duce la desorbție din suportul solid. Ca atare, eluția probei poate fi facilitată prin scăderea gradientului de sare. Modificatori organici ușori sau detergenți pot fi, de asemenea, adăugați la tamponul de eluție pentru a ajuta la procesul de eluție.
folosind principiile HIC, puteți lega proteinele din soluții apoase în grade diferite, în funcție de structura proteinei dvs. de interes, concentrația de sare, pH, temperatură și solvenți organici utilizați.
Cromatografie De Interacțiune Hidrofobă: Descoperind teoriile subiacente
există trei teorii majore care pot ajuta la explicarea mecanismului din spatele HIC – (1) Teoria sărării, (2) Teoria termodinamică și (3) tensiunea superficială sau teoria forțelor Van der Waals.
teoria Sărării
conform teoriei sărării, aminoacizii hidrofobi formează zone hidrofobe protejate la plierea în soluție apoasă, în timp ce aminoacizii hidrofili permit proteinelor să se lege cu moleculele de hidrogen din apă. Ca urmare, probabilitatea ca proteina să se dizolve în apă va crește dacă pe suprafața moleculelor de proteine sunt prezente suficiente zone hidrofile.
cu toate acestea, la adăugarea de săruri anti-chaotrofe (cum ar fi sulfatul de amoniu și sulfatul de sodiu) în soluție, unele dintre moleculele de apă vor interacționa cu ionii de sare în locul părții încărcate a proteinei. Când interacțiunile proteină-proteină din soluție devin mai puternice decât interacțiunile solvent-solut, moleculele de proteine reacționează liber între ele – permițându-le să se agregeze și, în cele din urmă, să precipite din soluție. Prin urmare, adăugarea de sare în soluție reduce solubilitatea diferitelor proteine în diferite proporții.
teoria termodinamicii
această teorie afirmă că interacțiunea dintre moleculele hidrofobe este un proces condus de entropie, bazat pe a doua lege a termodinamicii. Interacțiunea hidrofobă dintre două sau mai multe molecule nepolare într-o soluție de solvent polar este un proces spontan guvernat de o schimbare a entropiei. Cu toate acestea, astfel de interacțiuni pot fi modificate prin controlul temperaturii sau prin modificarea polarității solventului.
ca atare, atunci când o moleculă nepolară intră în contact cu un solvent polar, cum ar fi apa, va exista o creștere a gradului de ordine a moleculelor de solvent care înconjoară molecula hidrofobă. Atâta timp cât entalpia nu crește semnificativ, aceasta va produce o scădere a entropiei și va oferi o schimbare generală pozitivă a energiei Gibbs. Ca atare, dizolvarea unei molecule nepolare într-un solvent polar nu va avea loc spontan, deoarece nu este favorabilă termodinamic.
cu toate acestea, atunci când puneți două sau mai multe molecule nepolare într-un mediu polar, suprafețele hidrofobe ale macromoleculelor vor fi ascunse de mediul polar și moleculele hidrofobe se vor agrega spontan. Moleculele de solvent foarte structurate care înconjoară suprafața expusă a moleculelor hidrofobe vor fi deplasate spre cea mai mare parte a solventului constând din molecule mai puțin structurate. În consecință, entropia crește în timp ce energia Gibbs scade. În astfel de cazuri, interacțiunea hidrofobă devine un proces favorabil termodinamic.
tensiune superficială, teoria Van der Waals
această teorie sugerează că interacțiunea hidrofobă în HIC depinde de forțele van der Waals dintre proteine și liganzi imobilizați, deoarece aceste forțe cresc pe măsură ce structura ordonată a apei crește în prezența sărării sărurilor.