La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es uno de los métodos más utilizados para separar y purificar proteínas en su estado nativo. HIC también demuestra ser muy útil en el aislamiento de complejos de proteínas y en el estudio del plegado y despliegue de proteínas. Entonces, ¿cómo funciona el HIC? ¿Cuáles son los principios detrás de esta técnica? Para entender el mecanismo detrás de este tipo de cromatografía, aquí hay algunas cosas que definitivamente necesita saber.
¿Cómo Actúa el HIC?
En pocas palabras, el HIC (también conocido como «salazón») separa las moléculas de proteínas utilizando las propiedades de hidrofobicidad. En este método, las proteínas que contienen regiones hidrofílicas e hidrofóbicas se aplican a una columna de HIC en condiciones de tampón alto en sal.
La sal en el tampón (generalmente sulfato de amonio) reduce la solvatación de los solutos de muestra y expone las regiones hidrofóbicas a lo largo de la superficie de la molécula de proteína. Esto facilita la adsorción de estas regiones hidrofóbicas a las áreas hidrofóbicas en el soporte sólido y precipita (cristaliza) proteínas de la solución.
Tenga en cuenta que al realizar este tipo de cromatografía, la adición de sales liotróficas mejora el efecto hidrofóbico y reduce el número y el volumen de cavidades hidrofóbicas individuales, mientras que la disminución de la concentración de sal dará lugar a la desorción del soporte sólido. Como tal, la elución de la muestra se puede facilitar a través de la disminución del gradiente de sal. También se pueden agregar modificadores orgánicos suaves o detergentes al tampón de elución para ayudar en el proceso de elución.
Utilizando los principios de HIC, puede unir proteínas de soluciones acuosas en diversos grados dependiendo de la estructura de su proteína de interés, la concentración de sal, el pH, la temperatura y los disolventes orgánicos utilizados.
Cromatografía de Interacción Hidrofóbica: Descubrir las Teorías Subyacentes
Hay tres teorías principales que pueden ayudar a explicar el mecanismo detrás de HIC: (1) la teoría de salazón, (2) la teoría termodinámica y (3) la teoría de la tensión superficial o la teoría de las fuerzas de Van der Waals.
Teoría de salazón
De acuerdo con la teoría de salazón, los aminoácidos hidrofóbicos forman áreas hidrofóbicas protegidas al plegarse en solución acuosa, mientras que los aminoácidos hidrofílicos permiten que las proteínas se unan con las moléculas de hidrógeno en el agua. Como resultado, la probabilidad de que la proteína se disuelva en agua aumentará si hay suficientes áreas hidrofílicas presentes en la superficie de las moléculas de proteína.
Sin embargo, al agregar sales anticaotróficas (como sulfato de amonio y sulfato de sodio) en la solución, algunas de las moléculas de agua interactuarán con los iones de sal en lugar de la parte cargada de la proteína. Cuando las interacciones proteína-proteína en la solución se vuelven más fuertes que las interacciones disolvente-soluto, las moléculas de proteína reaccionan libremente entre sí, lo que les permite agregarse y, finalmente, precipitarse fuera de la solución. Por lo tanto, la adición de sal en la solución reduce la solubilidad de diferentes proteínas en diferentes grados.
Teoría de la termodinámica
Esta teoría establece que la interacción entre moléculas hidrofóbicas es un proceso impulsado por la entropía, basado en la segunda ley de la Termodinámica. La interacción hidrofóbica entre dos o más moléculas no polares en una solución de disolvente polar es un proceso espontáneo gobernado por un cambio en la entropía. Sin embargo, estas interacciones pueden alterarse controlando la temperatura o modificando la polaridad del disolvente.
Como tal, cuando una molécula no polar entra en contacto con un solvente polar como el agua, habrá un aumento en el grado de orden de las moléculas de solvente que rodean la molécula hidrofóbica. Mientras la entalpía no aumente significativamente, esto producirá una disminución en la entropía y proporcionará un cambio positivo general en la energía de Gibbs. Como tal, la disolución de una molécula no polar en un solvente polar no ocurrirá espontáneamente ya que no es termodinámicamente favorable.
Sin embargo, cuando se colocan dos o más moléculas no polares en un entorno polar, las superficies hidrofóbicas de las macromoléculas se ocultarán del entorno polar y las moléculas hidrofóbicas se agregarán espontáneamente. Las moléculas de solvente altamente estructuradas que rodean la superficie expuesta de las moléculas hidrofóbicas se desplazarán hacia el grueso del solvente que consiste en moléculas menos estructuradas. Como consecuencia, la entropía aumenta mientras que la energía de Gibbs disminuye. En tales casos, la interacción hidrofóbica se convierte en un proceso termodinámicamente favorable.
Tensión superficial, Teoría de Van der Waals
Esta teoría sugiere que la interacción hidrofóbica en HIC depende de las fuerzas de van der Waals entre proteínas y ligandos inmovilizados, ya que estas fuerzas aumentan a medida que aumenta la estructura ordenada del agua en presencia de sales de sal.