udviklingen og gradvise forbedringer af gær to-hybrid system (Y2H) siden begyndelsen af 90 ‘ erne revolutionerede den måde, protein interaktioner kunne detekteres1.
gær-to-hybrid er baseret på rekonstitution af en funktionel transkriptionsfaktor (TF), når to proteiner eller polypeptider af interesse interagerer. Dette finder sted i genetisk modificerede gærstammer, hvor transkriptionen af et reportergen fører til en specifik fænotype, normalt vækst på et selektivt medium eller ændring i farven på gærkolonierne. De mest populære reportergener er HIS3 til at vælge gær på et medium, der mangler histidin, og Lacs til at screene gær i et kolorimetrisk assay.
de tekniske detaljer for en gær-to-Hybrid-analyse er beskrevet i tegneserien nedenfor.
to fusioner (‘hybrider’) er konstrueret mellem hvert protein af interesse og enten DNA-Bindingsdomænet (DBD) eller Aktiveringsdomænet (AD) for TF. Proteinet smeltet til DBD kaldes ‘agn’, og proteinet smeltet til AD som’Bytte’.
efter interaktion mellem AGN og bytte bringes DBD og AD i nærheden, og en funktionel TF rekonstitueres opstrøms for reportergenet. De mest populære fusioner bruger DBD og AD af gæren TF Gal4. Bakterieproteinet bruges også ofte som en DBD i kombination med Gal4 AD.
som en genetisk teknik tilbyder en gær-to-hybridskærm et følsomt og omkostningseffektivt middel til at teste den direkte interaktion mellem to målrettede proteiner eller at bruge ens yndlingsprotein som lokkemad til at screene biblioteker af proteinfragmenter fremstillet ud fra de ønskede celletyper, væv eller hele organismer. Identiteten af de interagerende partnere opnås derefter ved sekventering af de tilsvarende plasmider i de valgte gærkolonier. Samlinger af proteiner i fuld længde (‘ORFeomes’) bliver også tilgængelige for flere arter, men de dækker ikke hele proteomet endnu.
gær-to-hybridsystemet blev hurtigt vedtaget af det videnskabelige samfund, og skærme inden for forskellige arter og forskningsområder førte allerede til snesevis af tusinder af publikationer. Det forbliver den valgte metode, når det kommer til at opdage nye proteininteraktioner, som afspejlet i den nyligt offentliggjorte litteratur.
variationer af Y2H blev udviklet til at udføre skærme i nærvær af en cofaktor eller et ferment, der kræves til en given post-translationel modifikation af proteinpartnerne2.
andre versioner gør det muligt at screene integrerede membranproteiner3 og teknikken blev tilpasset til at detektere protein-protein-interaktioner i pattedyrceller4. Endelig blev gær n-hybrid protokoller også udtænkt til at screene for nyt DNA-protein5, RNA-protein6 og små molekyle-protein interaktioner7.
Opdag Hybrigenics nyeste optimeret gær to-Hybrid skærm service: ULTImate Y2H.
Kontakt vores hold af forskere for gratis råd om dit projekt.
1. Felter, S. og sang, O. et nyt genetisk system til påvisning af protein-proteininteraktioner (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. og Arpin, M. rumlig rekruttering og aktivering af Fes-kinasen af esrin fremmer HGF-induceret cellespredning (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. og te Heesen, S. Et genetisk system baseret på split-allestedsnærværende til analyse af interaktioner mellem membranproteiner in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, K. V., Vandekerckhove, J. og Tavernier, J. Design og anvendelse af en cytokin-receptorbaseret interaktionsfælde (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Isolering af ORC6, en komponent i gæroprindelseskomplekset ved et one-hybrid system (1993) videnskab 262(5141), 1870-1874
6. P. og Kuhl, D. Et tri-hybrid system til analyse og påvisning af RNA-proteininteraktioner (1996) nukleinsyrer Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. og Liu, J. O. et trehybridsystem til påvisning af lille ligandprotein
receptorinteraktioner (1996) PNAS 93(23), 12817-12821