5.3 miRNA-medieret regulering af mål
inden for RISC interagerer miRNA med målgener via baseparring. Interaktionen mellem et miRNA og dets mål-mRNA er begrænset til 5′ – enden af miRNA. Sekvensekomplementaritet mellem nukleotider 2-8, også kendt som “frøregionen”, er afgørende for målsekvensgenkendelse , selvom undtagelser fra denne regel er blevet demonstreret . Oftest er miRNA-bindingssteder til stede i 3 ‘- ikke-oversat region (UTR) af mål-mRNA ‘ er, normalt i flere kopier . Imidlertid har miRNA også vist sig at målrette mod 5′-UTR og kodende regioner af mRNA . En undersøgelse foretaget af Tay et al. demonstreret, at et netværk af miRNA kan binde til flere steder inden for kodningen og 3’-UTR for et enkelt mRNA-mål, hvilket øger kompleksiteten af miRNA-medieret målregulering . Graden af komplementaritet mellem miRNA ‘s frøområde og bindingsstedet i mål-mRNA’ et bestemmer den mekanisme, hvormed miRNA regulerer målet . Hvis miRNA viser tilstrækkelig sekvensekomplementaritet (næsten perfekt) til mål-mRNA ‘et, udføres regulering ved en proces kaldet RNA-interferens, hvorved RISC er rettet mod at spalte mål-mRNA’ et . Hvis der ikke er tilstrækkelig komplementaritet , hvilket generelt er tilfældet hos pattedyr, opnås regulering ved undertrykkelse af translation og/eller destabilisering af mRNA .
kernekomponenterne i RISC er Argonaute (Ago) – familien af proteiner, som spiller en nøglerolle i dens funktion . Alle fire pattedyrsproteiner (Ago1-Ago4) kan lede den translationelle undertrykkelse af et mål-mRNA, men kun Ago2 har “slicer” – aktivitet og er ansvarlig for spaltning af mål-mRNA . Den eller de nøjagtige mekanismer for miRNA-medieret translationel undertrykkelse af målgener er stadig usikker . Flere undersøgelser har givet bevis for, at translationel undertrykkelse forekommer før påbegyndelse af oversættelse . Andre undersøgelser antyder imidlertid, at undertrykkelse forekommer efter påbegyndelse af oversættelse . Det blev oprindeligt antaget, at miRNA-medieret undertrykkelse af målgener overvejende blev reflekteret på proteinniveauet uden eller minimal effekt på mRNA-niveauer. Imidlertid er det nu blevet påvist, at miRNA-medieret undertrykkelse af målgener ofte er forbundet med destabilisering af mRNA, skønt det ikke vides, om dette er en sekundær effekt af translationel undertrykkelse. miRNA-medieret nedbrydning af mRNA-mål involverer deadenylering (fjernelse af Poly a-halen) efterfulgt af decapping og eksonukleolytisk fordøjelse . Derudover menes forarbejdningsorganer (P-kroppe), cytoplasmatiske strukturer involveret i opbevaring og nedbrydning af mRNA, også at spille en rolle i miRNA-regulering . miRNA menes at lede målet mRNA og associerede RISC-proteiner til disse lagringsstrukturer, som er beriget for mRNA-nedbrydning og translationelle undertrykkelsesfaktorer . Mekanismerne, der dikterer, om et mål-mRNA følger nedbrydnings-eller translationel undertrykkelsesvej, er i øjeblikket ukendt. Tilføjelse til kompleksiteten af miRNA-medieret regulering er de nylige opdagelser, der under forskellige stressbetingelser miRNA-induceret undertrykkelse af mål kan vendes, og at miRNA kan aktivere oversættelse af mål-mRNA .
miRNA-medieret regulering ser ud til at være en ekstremt dynamisk proces, dens kompleksitet øges ved, at perfekt komplimentaritet til målet ikke er påkrævet for regulering. Dette indikerer, at et enkelt miRNA har potentialet til at regulere flere målgener. Derudover kan et netværk af miRNA fungere samtidigt for at regulere et enkelt mRNA. Dette gør i sidste ende i silico identifikation af målgener og belysning af miRNA-funktion meget vanskeligere.
frøområdet, der er placeret i position 2-7 fra 5′ – enden af miRNA, anvendes af RISC som et nukleationssignal til genkendelse af mål-mRNA . På mRNA betegnes de tilsvarende steder som”frøsteder”. Der er en række stringencies forbundet med mål frø site anerkendelse og binding . En streng frø site har perfekt vand-Crick binding og kan opdeles i fire “frø” typer: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 og 6mer . Hver af disse typer varierer afhængigt af kombinationen af nukleotid i position 1 og parring i position 8. 8mer har både en adenin i position 1 på mRNA-målstedet og baseparring i position 8. En adenin på målstedet svarende til position 1 i et miRNA vides at øge effektiviteten af målgenkendelse . 7mer-A1 har kun en adenin i position 1, mens 7mer-m8 kun har baseparring i position 8. Derimod har 6mer hverken en adenin i position 1 eller baseparring i position 8 .
ud over streng frøgenkendelse er moderat streng genkendelse også mulig, da RISC kan tolerere små uoverensstemmelser eller vingleparring inden for frøområdet. Den termodynamiske stabilitet af en slingrende parring (f .eks G:U) kan sammenlignes med den for en parring med vand–Crick.
parring af vand–Crick i 3′ – delen af miRNA-molekylet er kendt for at forbedre site-genkendelseseffektiviteten i miRNA-mål, der har frøparring . Det foretrukne nukleotidantal af kampe i 3 ‘ – delen adskiller sig mellem det sted, der har parring med stringent frø, og det, der har parring med moderat stringent frø . Strenge frø kræver 3-4 kampe i positionerne 13-16, mens moderate-strenge frø kræver 4-5 kampe i positionerne 13-19. Steder med denne ekstra 3′ parring kaldes 3-supplerende og 3’ kompenserende steder .
det er blevet udførligt demonstreret, at langt størstedelen af miRNA-målgenkendelsessekvenser findes i 3′-UTR af målgenet, selvom miRNA-belastet RISC i teorien kan binde ethvert segment af mRNA. Målgener har generelt længere 3 ‘UTR, mens visse allestedsnærværende gener, såsom husholdende gener, har tendens til at have kort 3’ UTR, potentielt for at undgå at blive reguleret af miRNA . Målsteder er ikke jævnt fordelt med 3 ‘ UTR. De er placeret i nærheden af begge ender på lang 3 ‘ UTR (generelt kr 2000 nt). For kortere 3 ‘ UTR har målsteder tendens til at være ~15-20 nt væk fra stopkodonet .
mens det generelt anses for, at funktionelle miRNA-steder fortrinsvis er placeret i 3′ UTR, kan frøsteder i kodningssekvensen og 5′ UTR-regioner også fremme mRNA-nedregulering . Grundlaget for præferentiel miRNA-binding i 3′ UTR kan have en række forklaringer. For eksempel kan RISC muligvis konkurrere med andre proteinkomplekser, såsom ribosomer, binding til kodningssekvensen og translationsinitieringskomplekser i 5′ UTR. Som sådan kan 3 ‘ UTR simpelthen være mere tilgængelig for langsigtet binding end de to andre steder .