rollen af Proteinmodifikationer af T-Bet i cytokinproduktion og differentiering af T-hjælperceller

Abstract

T-Bet (T-boks protein udtrykt i T-celler, også kaldet TBH21) blev oprindeligt klonet som en vigtig transkriptionsfaktor involveret i T-hjælpercellernes (TH) engagement i Th1-slægten. T-Bet aktiverer direkte IFN-gentranskription og forbedrer udviklingen af Th1-celler. T-Bet modulerer samtidig IL – 2 og Th2 cytokiner på en IFN-uafhængig måde, hvilket resulterer i en dæmpning af Th2-celleudvikling. Talrige undersøgelser har vist, at T-bet spiller flere roller i mange undertyper af immunceller, herunder B-celle, dendritiske celler, naturlige dræberceller (NK), NK T-celler og medfødte lymfoide celler. Derfor er T-bet afgørende for udvikling og koordinering af både medfødte og adaptive immunresponser. For at udføre disse flere roller, t-bet gennemgår flere posttranslationelle proteinmodifikationer, såsom phosphorylering ved tyrosin, serin, og threonin rester, og allestedsnærværende ved lysinrester, som påvirker afstamningsengagement under celledifferentiering. Denne gennemgang præsenterer en aktuel oversigt over de fremskridt, der er gjort med at forstå rollerne for forskellige typer t-bet-proteinmodifikationer i reguleringen af cytokinproduktion under TH-celledifferentiering.

1. Indledning

T-Bet (T-boks protein udtrykt i T-celler, også kaldet TBH21) blev først beskrevet i 2000 i en rapport, der undersøgte virkningerne af T-bet på differentieringen af T-hjælper 1 (Th1) celler . For fortiden 15 flere år, mange undersøgelser har undersøgt funktionerne i T-bet og har afsløret flere roller for dette protein under celledifferentiering, med fokus på de involverede molekylære mekanismer, de nye funktioner af denne transkriptionsfaktor i medfødte immunceller, og T-bet-medieret modulering af inflammatoriske sygdomme . Det er blevet præciseret, at T-bet spiller en kritisk rolle i koordineringen af medfødt immunitet og adaptiv immunitet, og at det opfylder en vigtig funktion i modulering af kroniske inflammatoriske sygdomme, herunder astma og inflammatorisk tarmsygdom, ved at kontrollere et netværk af stærkt konserverede genetiske programmer . Således synes optimal regulering af t-bet-ekspression og-aktivitet at være gavnlig til forebyggelse eller behandling af kronisk inflammation og autoimmune sygdomme.

selvom der er gjort forsøg på at identificere de små molekyler, der styrer ekspressionen og aktiviteten af T-bet, der påvirker det t-cellemedierede immunrespons, er der kun gjort små fremskridt på dette til dato. I betragtning af vigtigheden af T-bet i immunreguleringen vil belysning af de funktionelle mekanismer, der ligger til grund for T-bets flere roller, lette udviklingen af nye terapeutiske interventioner til behandling af kroniske inflammatoriske og autoimmune sygdomme. Denne gennemgang opsummerer den aktuelle viden om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for de flere roller, som T-bet spiller i celleudviklingen.

2. Struktur af T-Bet

T-bet indeholder en amino-Terminal, et T-boks-domæne og en carboksyl-Terminal, som viser henholdsvis 82%, 100% og 79% homologi mellem mus (530 aminosyrerestprotein) og mennesker (535 aminosyrerestprotein) (Figur 1). T-boksdomænet, der ligger mellem rester 135 og 326 i mus T-bet, er stærkt konserveret i 18 medlemmer af T-boks-proteinfamilien . Fælles træk, der deles af T-boksproteiner, inkluderer en kapacitet til DNA-binding gennem T-boksdomænet og transkriptionel regulatorisk aktivitet, som spiller en rolle i at kontrollere ekspressionen af udviklingsgen i alle dyrearter.

Figur 1

struktur og protein modifikation af T-bet. Mus og menneskelig t-bet er 100% identisk i T-boks domænet. Flere aminosyrerester konserveres hos mus og gennemgår posttranslationelle modifikationer, herunder phosphorylering ved serin -, threonin-og/eller tyrosinrester og allestedsnærværende ved lysinrester.

180 aminosyrerester og er både tilstrækkelig og nødvendig til binding til konsensus-DNA-sekvensen TCACACCT . Brachyury (T) var det første t-boksprotein, der blev identificeret og interagerer i dimerisk form med de store og mindre riller af DNA gennem hydrofobe interaktioner og usædvanlig hovedkædekarbonylkontakt med en guanin som en dimer . TBH1 binder også til DNA-sekvensen som en dimer, hvorimod TBH2 ser ud til at binde til den samme DNA-sekvens som en monomer . Selvom TBH1 og TBH2 deler 61% identitet i T-boksdomænet, synes strukturen af DNA-t-boksbindingskomplekset at være anderledes på grund af den lave homologi blandt amino – og carboksyl-terminale regioner. T-boksdomænet i T-bet viser 50% homologi med det tilsvarende domæne i brachyury (T), TBH1 og TBH2; imidlertid forbliver krystalstrukturen af T-bet bundet til DNA-sekvensen at være karakteriseret.

3. Regulering af TH celledifferentiering ved T-Bet

3.1. Stimulering af Th1-celledifferentiering med T-Bet

T-bet binder direkte til konsensus-DNA-sekvensen inden for IFNG-promotoren og aktiverer dens transkription. Den T-bet-inducerede ekspression af IFNG stammer TH precursorceller til at differentiere til Th1 effektorceller. Mens eksogen t-bet-overekspression i na-karristve TH-celler fortrinsvis øger udviklingen af Th1-celler, fører t-bet-mangel til en manglende produktion af tilstrækkelig IFN-Karri og reducerer derfor dannelsen af Th1-celler . T-Bet-ekspression øges væsentligt ved stimulering af T-cellereceptoren (TCR) og forstærkes ved cotreatment med IFN-kurr og IL-12. IFN-Lars binder til dets receptor og inducerer aktivering af signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) 1 og transkription af t-bet-genet (TBH-21). Derefter stimulerer T-bet direkte transkriptionen af IFNG såvel som IL12RB2. Ekspression af IL-12-receptor (IL-12R) kur2 på celleoverfladen forbedrer IFN-kur-produktionen yderligere gennem IL-12 og STAT4-signalvejen, hvilket resulterer i præferentiel Th1-celledifferentiering. Interessant nok kan håndhævet t-bet-udtryk også konvertere de differentierede Th2-celler til Th1-celler . Derfor, T-bet er placeret ved kernen i de regulatoriske veje, der inducerer IFN-kur i TH-celler.

3.2. Dæmpning af IL – 2-produktion ved T-Bet

ud over IFN-Krust-regulering undertrykker T-bet signifikant udtryk. Dette cytokin, en tidlig t-cellevækstfaktor, er afgørende for aktivering, proliferation og differentiering af TH-celler og produceres rigeligt ved TCR-stimulering. Ektopisk indført t-bet undertrykker signifikant IL-2-produktion gennem inhibering af nuklear faktor kB (NF-kB) p65-aktivitet under betingelser med både Th1-og Th2-differentiering . Under Th1-celledifferentiering dæmpes IL-2-transkription også ved induktion af T-bet. Den T-bet-medierede IL – 2-hæmning kan påvirke TH-celleudvidelsen og udsøgt modulere det Th1-medierede immunrespons ved eksponering for et patogen antigen.

3.3. Undertrykkelse af Th2-celleudvikling ved T-Bet

desuden undertrykker eksogen t-bet-indføring i TH-celler produktionen af Th2-cytokiner, såsom IL-4, IL-5 og IL-13, via undertrykkelse af GATA-bindende protein-3 (GATA-3). Følgelig inducerer mangel på T-bet spontan Th2-celleudvikling in vitro og in vivo . Den Th2-suppressive aktivitet af T-bet blev også bekræftet i fravær af IFN-kurr, hvilket indikerer, at T-bet har en diskret hæmmende funktion, uafhængig af IFN-kurr-stimulering.

3.4. Andre funktioner af T-Bet

for nylig har mange undersøgelser rapporteret, at T-bet også modulerer andre TH-cellelinjer, herunder Th17 -, Treg-og follikulære TH-celler (TFH) i koordination med mange transkriptionsfaktorer, såsom den retinsyre-relaterede forældreløse receptor-yt (RORyt), runt-relateret transkriptionsfaktor 3 (RUNKS3) og B-celle lymfom-6 (BCL6) . Disse fund antyder, at T-bet er en transkriptionsfaktor, der er kritisk for finjustering af celleudviklingen.

4. Posttranslational modifikation af T-Bet

T-Bet fungerer som en multitasking spiller i reguleringen af TH celledifferentiering. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for den stimulerende og hæmmende aktivitet af T-bet til regulering af målgenekspression, fortsat at blive afklaret. Mange multitasking-proteiner er kendt for at gennemgå posttranslationelle proteinmodifikationer og bestemme cellefader ved at udøve direkte stimulerende og indirekte hæmmende aktivitet på målgenekspression .

4.1. Tyrosinphosphorylering af T-Bet

Antistofbaseret detektion af t-bet-proteiner i vestlige blots resulterer i flere bånd, hvilket antyder den posttranslationelle modifikation af T-bet i TCR-udløste TH-celler. Tyrosinphosphorylering af T-bet-protein forekommer primært i de tidlige stadier (dag 2 til 3) af celleudviklingen efter TCR-engagement og falder bagefter. Behandling af Th-celler med tyrosinphosphatasehæmmeren pervanadat forbedrer tyrosinphosphoryleringen af T-bet. T-Bet er hovedsageligt lokaliseret i kernen, og den nukleare tyrosinkinase IL2-inducerbare tyrosinkinase (ITK) blev identificeret som den ansvarlige opstrøms tyrosinkinase. ITK-mangel forhindrer tyrosinphosphorylering af T-bet i TH-celler efter stimulering med TCR og IL-12. Mutationsforskning har vist, at tyrosinrest 525 (Y525) er det relevante phosphoryleringssted, og at phosphorylering på dette sted spiller en vigtig rolle i interaktionen med GATA-3. Selvom t-boksdomæne i T-bet er vigtigt for DNA-og protein-protein-interaktion, er tyrosinphosphorylering af Y525 en forudsætning for undertrykkelse af Gata-3-medieret Th2-celledifferentiering. Blokade af y525 phosphorylering ophæver interaktionen med og suppression af GATA-3, hvilket resulterer i svækkelse af Th2 suppression .

desuden inducerer en anden nuklear tyrosinkinase, c-Abl, phosphorylering af T-bet ved tyrosinrester 219, 265 og 304 i mus t-bet . En mangel på c-Abl såvel som mutation af T-bet ved disse rester (y219/265/304F mutanter) fører til en manglende forøgelse af IFN-larrus-induktionen og undertrykkelse af Th2-cytokinproduktion på grund af tabet af phosphorylering ved disse tyrosinrester. Dette resulterer igen i forværring af allergisk lungebetændelse in vivo . Disse fund antyder, at ITK – og c-Abl-induceret tyrosinphosphorylering af T-bet er afgørende for moduleringen af Th2-celleudvikling og det allergiske immunrespons.

4.2. Serinfosforylering af T-Bet

selvom T-bet-medieret undertrykkelse af Th2-celleudvikling er svækket af mutation af Y525 og fraværet af c-Abl-kinase, bevares IL-2-suppression med en Y525-mutant T-bet, hvilket antyder eksistensen af en yderligere reguleringsmekanisme til IL-2-modulering . Interessant nok kunne udseendet af flere bånd af T-bet-protein på vestlige blots elimineres ved tilsætning af kalvtarmphosphatase, som overvejende eliminerer phosphorylering ved serin/threoninrester. Massespektrometrisk analyse afslørede derefter serin 508 (S508) som et andet phosphoryleringssted i T-bet. Mutation af S508 afskaffer kasein kinase – (CK -) og glycogensyntasekinase-3 (GSK-3 -) medieret phosphorylering i T-bet såvel som den IL–2-undertrykkende aktivitet af proteinet. Desuden er s508-phosphorylering vigtig for interaktionen mellem T-bet og NF-kB p65 og for at forhindre binding af NF-kB p65 til IL2-promotoren. I overensstemmelse med funktionen af T-bet som en NF-kB p65-hæmmer opretholder t-bet-null Th1-celler NF-kB p65-aktivitet under Th1-celledifferentiering og producerer således mere IL-2. Derfor er det blevet foreslået, at T-bet er en fysiologisk hæmmer af IL-2 under Th1-celledifferentiering gennem s508 phosphoryleringsafhængig undertrykkelse af NF-kB p65.

4.3. Threonin phosphorylering af T-Bet

for nylig blev threonin 302 (T302) karakteriseret som et nyt phosphoryleringssted i T-bet, skønt det stadig er uklart , hvilken kinase og phosphatase der påvirker phosphoryleringen af denne rest. Imidlertid, restaurering af t-bet-null TH-celler med en T302-mutant T-bet stimulerede IFN-rels produktion lige så meget som vildtype T-bet; imidlertid, mutanten undlod at undertrykke IL-2 og andre Th2 cytokiner. Yderligere analyse viste, at t302-phosphorylering er nødvendig for interaktionen mellem T-bet og nuklear faktor af aktiverede T-celler (NFAT) og for nedregulering af NFAT-medierede IL-2-og Th2-cytokiner, såsom IL-4, IL-5 og IL-13. NFAT er ikke afgørende for induktion af IFN-kursproduktion, og T302-mutant T-bet er i stand til at binde til IFNG-promotoren; således var IFN-kurrusproduktionen sammenlignelig mellem vildtype og mutant T-bet. Med andre ord ophævede mutationen af T302 den T-bet-medierede suppression af IL-2 og Th2 cytokinproduktion, men påvirkede ikke t-bets DNA-bindende og IFN-Karr-stimulerende aktivitet.

faktisk er T302 placeret i den DNA-bindende T-boks, ligesom Y304 . T-boksdomænet består af flere gentagelser af Kurt-strenge og Kurt-helices og er involveret i både dimerisering og DNA-binding . Muller og Herrmann forudsagde, at karruselerne aH3 og aH4 i brachyury (T) er vigtige for den direkte interaktion mellem dette protein og de mindre og større riller i DNA . Imidlertid er T302 muligvis ikke forbundet direkte med DNA-rillerne, uanset dets phosphoryleringsstatus. Det ville være interessant at vide, hvilken opstrøms kinase og phosphatase regulerer t302-phosphorylering, og om t302-phosphorylering påvirker andre proteinmodifikationer af T-bet.

4.4. Allestedsnærværende lysin 313 i t-Bet

t-bet-ekspression er kritisk for transkriptionel regulering af IFNG og for udviklingen af Th1-celler, men midlerne til regulering af T-bet på proteinniveauet er endnu ikke identificeret. Jang et al. har for nylig rapporteret, at T-bet gennemgår allestedsnærværende medieret proteasomal nedbrydning i de senere stadier af Th1-celledifferentiering . Af de 16 lysinrester, der er til stede i mus-T-bet-protein, er 11 overvejende placeret inden for T-boksdomænet, og de resterende 5 er placeret ved carboksyl-terminalen (rester 326 til 530), mens der ikke er nogen lysinrester til stede i amino-terminalen (rester 1 til 134). Interessant nok er lysinrester inden for T-boksdomænet fortrinsvis allestedsnærværende ved overekspression af allestedsnærværende. Yderligere analyse har identificeret, at mutation af lysin 313 (K313) nedsætter allestedsnærværende medieret t-bet-nedbrydning og forbedrer ekspressionsniveauet for T-bet i kernen og cytoplasmaet. På trods af de øgede niveauer af k313-mutanten ophævede denne mutation fuldstændigt T-bet-funktioner, der involverede DNA-binding, transkriptionel aktivering af IFNG og undertrykkelse af IL-2 og Th2 cytokinproduktion. Krystalstrukturen i T-boksdomænet, der er bundet til DNA, antyder kraftigt, at aminogruppen af K313 er forbundet med phosphatet af en DNA-base via hydrogenbindingsinteraktion. Derudover fører mutation af K313 også til manglende undertrykkelse af IL-2 og Th2 cytokinproduktion; interaktionen med og undertrykkelsen af GATA-3 og NF-kB p65 ændres imidlertid ikke ved mutation af K313. Interessant nok afskaffes nfat-interaktion i K313-mutant T-bet, som også er stærkt forbundet med et fravær af phosphorylering ved T302. Det er endnu ikke klart, om og hvordan K313 regulerer t302-phosphorylering og omvendt.

5. T-Bet i inflammatoriske og Autoimmune sygdomme

siden Mosmann et al. opdagede Th1-og Th2-delmængder, der producerer signaturcytokiner, IFN-kur, og IL-4, IL-5, og IL-13, henholdsvis , og som modulerer inflammatoriske og allergiske immunresponser, yderligere undersøgelser har identificeret nye delmængder af TH-celler, såsom Th17, TFH, og Treg-celler . Omfattende undersøgelser har også karakteriseret cytokinsignalveje og transkriptionsfaktorer involveret i reguleringen af immunrespons på patogener . Det er vigtigt, at T-bet spiller en grundlæggende rolle i at kontrollere differentiering af flere undergrupper af TH-celler og i modulering af inflammatoriske og autoimmune sygdomme .

T-Bet fungerer også som en antiastmatisk regulator. En mangel i T-bet fører spontant til udvikling af astmatiske symptomer, som er kendetegnet ved øget eosinofil infiltration i luftvejene, slimudskillende bægercellehyperplasi og kronisk luftvejsomdannelse med kollagenakkumulering og proliferative myofibroblaster; disse træk ses ofte også hos astmatiske patienter . Gendannelse af t-bet-ekspression skifter immunbalancen til et Th1-respons og forhindrer og dæmper patologisk lungebetændelse in vivo .

desuden er T-bet beskyttet mod intracellulære patogene infektioner. Ophævelse af T-bet-induceret IFN-kar-produktion resulterede i højere modtagelighed for intracellulære patogener in vivo, inklusive Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major, og Salmonella typhimurium , understreger vigtigheden af IFN-kar-produktion ved T-bet-at udtrykke Th1-celler i forsvaret mod bakterielle infektioner. Imidlertid er t-bet-mangelfulde mus resistente over for infektion med Listeria monocytogenes, fordi INF-kursproduktion af naturlige dræberceller er både nødvendig og tilstrækkelig til værtsforsvaret mod L. monocytogenes .

desuden kan T-bet forværre udviklingen af inflammatoriske og autoimmune sygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, inflammatorisk arthritis og type i-diabetes, da disse inflammatoriske sygdomme svækkes i fravær af T-bet . Disse fund tyder på, at finjustering af immunresponset ved modulering af t-bet-ekspression kan have gavnlige virkninger for patienter med kronisk astma, inflammatorisk tarmsygdom, arthritis, multipel sklerose og diabetes.

6. Konklusioner og perspektiver

T-bet er en T-boks domæneholdig transkriptionsfaktor, der typisk er involveret i udviklingsregulering, men udøver flere funktioner i TH-celledifferentiering; transkriptionel aktivering af IFN-kurpressende Th1-celler, indirekte undertrykkelse af Th2 -, Th17-og Treg-celleudvikling og finmodulation af IL-2-produktion i Th1-celler. Denne multitasking er ikke overraskende, da T-bet gennemgår flere posttranslationelle ændringer. Phosphorylering ved Y525 spiller en rolle i Gata-3-undertrykkelse under Th2-regulering, phosphorylering ved S508 forårsager NF-kB p65-undertrykkelse i sammenhæng med IL-2-regulering i Th1-celler, phosphorylering ved T302 spiller en rolle i finjustering af IL-2-produktion, og allestedsnærværende ved K313 spiller en rolle i styringen af t-bet-proteinstabilitet. Således letter posttranslationel modifikation af T-bet dens funktionelle mangfoldighed og kompleksiteten af dens modulering af cytokinekspression (figur 2). Det vides ikke, om de forskellige posttranslationelle modifikationer forekommer sekventielt eller samtidigt, om en type proteinmodifikation påvirker anden modifikation, eller om ændringer i den posttranslationelle modifikation af T-bet er relateret til udviklingen af infektiøse og kroniske inflammatoriske sygdomme. Yderligere identifikation af nye proteinmodifikationer relateret til T-bet-funktioner ville give værdifuld indsigt i udviklingen af kraftige terapeutiske interventioner til kontrol af kroniske inflammatoriske og autoimmune sygdomme.

figur 2

flere t-bet funktioner spiller en rolle i TH celle differentiering. Induktion af t-bet-ekspression gennem aktivering af STAT1 og STAT4 stimulerer direkte transkriptionen af T-boks-bindende elementholdige gener, såsom IFNG, IL12RB2 og CKSCR3, hvilket forbedrer Th1-celleudviklingen. T-Bet gennemgår serinfosforylering ved S508 og nedregulerer derefter IL-2-produktion i Th1-celler ved at rekruttere NF-kB p65 fra IL2-promotoren. Proteinniveauer af T-bet i Th1-celler kan kontrolleres ved hjælp af den allestedsnærværende proteasomale nedbrydningsvej. Desuden gennemgår t-bet-protein yderligere posttranslationelle modifikationer, for eksempel phosphorylering ved T302 og Y525, hvilket letter dets undertrykkelse af Th2-cytokinproduktionen, der induceres ved aktivering af NFAT og GATA-3.

liste over forkortelser

interessekonflikt

ingen potentiel interessekonflikt blev afsløret.

anerkendelse

dette arbejde blev støttet af mid-Career forsker Program gennem NRF Grant (2013r1a2a2a01068302).