Die Entwicklung und schrittweise Verbesserung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (Y2H) seit den frühen 90er Jahren revolutionierte die Art und Weise, wie Proteininteraktionen nachgewiesen werden könnten1.
Hefe-Zwei-Hybrid basiert auf der Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors (TF), wenn zwei interessierende Proteine oder Polypeptide interagieren. Dies geschieht bei gentechnisch veränderten Hefestämmen, bei denen die Transkription eines Reportergens zu einem bestimmten Phänotyp führt, meist Wachstum auf einem selektiven Medium oder Veränderung der Farbe der Hefekolonien. Die beliebtesten Reportergene sind HIS3, um Hefe auf einem Medium ohne Histidin auszuwählen, und lacZ, um Hefe in einem kolorimetrischen Assay zu screenen.
Die technischen Details eines Hefe-Zwei-Hybrid-Assays sind in der folgenden Abbildung dargestellt.
Zwischen jedem Protein von Interesse und entweder der DNA-Bindungsdomäne (DBD) oder der Aktivierungsdomäne (AD) des TF werden zwei Fusionen (‚Hybride‘) konstruiert. Das an die DBD fusionierte Protein wird als ‚Köder‘ bezeichnet, und das an die AD fusionierte Protein als ‚Beute‘.
Bei Wechselwirkung zwischen Köder und Beute werden DBD und AD in unmittelbarer Nähe gebracht und ein funktioneller TF stromaufwärts des Reportergens rekonstituiert. Die beliebtesten Fusionen verwenden die DBD und AD der Hefe TF Gal4. Das bakterielle Protein LexA wird auch häufig als DBD in Kombination mit Gal4 AD verwendet.
Als Gentechnik bietet ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening ein empfindliches und kostengünstiges Mittel, um die direkte Interaktion zwischen zwei Zielproteinen zu testen oder das Lieblingsprotein als Köder zu verwenden, um Bibliotheken von Proteinfragmenten zu screenen, die aus den gewünschten Zelltypen, Geweben oder ganzen Organismen hergestellt wurden. Die Identität der wechselwirkenden Partner wird dann durch Sequenzierung der entsprechenden Plasmide in den ausgewählten Hefekolonien erhalten. Sammlungen von Proteinen voller Länge (‚Orfeome‘) werden auch für mehrere Arten verfügbar, aber sie decken noch nicht das gesamte Proteom ab.
Das Hefe-Zwei-Hybrid-System wurde schnell von der wissenschaftlichen Gemeinschaft übernommen und führte in verschiedenen Arten und Forschungsbereichen bereits zu Zehntausenden von Publikationen. Es bleibt die Methode der Wahl, wenn es darum geht, neue Proteininteraktionen zu entdecken, wie die kürzlich veröffentlichte Literatur zeigt.
Variationen von Y2H wurden entwickelt, um Screenings in Gegenwart eines Cofaktors oder eines Enzyms durchzuführen, das für eine bestimmte posttranslationale Modifikation der Proteinpartner erforderlich ist2.
Andere Versionen erlauben es, integrale Membranproteine zu screen3 und die Technik wurde angepasst, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in Säugetierzellen nachzuweisen4. Schließlich wurden auch Hefe-n-Hybrid-Protokolle entwickelt, um nach neuartigen DNA-Protein-5-, RNA-Protein-6- und Niedermolekül-Protein-Interaktionen7 zu suchen.
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1. Fields, S. und Song, O. Ein neuartiges genetisches System zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. und Arpin, M. Räumliche Rekrutierung und Aktivierung der Fes-Kinase durch Ezrin fördert die HGF-induzierte Zellstreuung (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. und te Heesen, S. Ein auf Split-Ubiquitin basierendes genetisches System zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S. , Verhee, A., der Heyden, JV, Lemmens, I., Ostade, XV, Vandekerckhove, J. und Tavernier, J. Design und Anwendung einer Zytokin-Rezeptor-basierten Interaktionsfalle (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, JJ und Herskowitz, I. Isolierung von ORC6, einer Komponente des Hefe-Ursprungserkennungskomplexes durch ein One-Hybrid-System (1993). 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. und Kuhl, D. Ein Tri-Hybrid-System zur Analyse und Detektion von RNA-Protein-Wechselwirkungen (1996) Nucleic Acids Res 24, 4838-4840
7. Licitra, EJ und Liu, JO Ein Drei-Hybrid-System zum Nachweis von kleinen Ligand-Protein
Rezeptor-Interaktionen (1996) PNAS 93 (23), 12817-12821